IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.5 Analisis RNA
RNA total yang terisolasi dari Xag YR32 dan Xag M715 dilihat kualitasnya melalui elektroforesis gel agarosa terdenaturasi dan hasilnya terlihat pada Gambar 23.
Gambar 23. Hasil elektroforesis sampel RNA total yang diisolasi dari berbagai Xanthomonas.
Gambar 23 memperlihatkan ada dua pita yang dominan, yaitu 23S rRNA dan 16S rRNA. Adanya dua pita tersebut berarti kualitas RNA total yang terisolasi sangat baik (Jaakola et al. 2001). RNA total dalam sel terdiri atas rRNA, tRNA, dan mRNA, kira-kira 80-85% dari total RNA adalah rRNA, 15-20% tRNA, sedangkan mRNA sekitar 1-5%. Total RNA muncul
smear dengan dua pita dominan. Pita ini adalah rRNA dan yang terlihat smear adalah mRNA dengan ukuran yang berbeda. Level mRNA steady state dalam sel merupakan integral dari hasil transkripsi dan degradasi. Pita RNA pada Xag YR32 dan Xag M715 sangat baik, sedangkan pada Xcc dan Xam, pita 16S rRNA dan 23S rRNA sangat tipis yang menunjukkan adanya degradasi RNA selama proses isolasi dan elektroforesis.
RNA total yang diisolasi kemudian ditranskripsi terbalik (Reverse Transcriptase, RT) dengan Gene Specific Primer (GSP) yaitu primer reverse impX, sehingga diperoleh cDNA. cDNA di PCR dengan primer reverse dan forward impX. Primer didisain dari urutan nukleotida impX yang sudah diperoleh. Hasil PCR dilarikan pada gel agarosa dan diperoleh pita ukuran sekitar 375 bp. Ukuran nukleotida sesuai dengan panjang nukleotida impX yang diapit oleh primer forward dan reverse impX (Gam bar 24).
Hasil RT-PCR pada Xag YR32 berbeda nyata dengan Xag M715, pada Xag YR32 jumlah amplikon jauh lebih banyak dibandingkan dengan Xag M715. Fenomena ini mengindikasikan bahwa jumlah mRNA impX M715 jauh lebih sedikit dibandingkan mRNA
impX YR32. Seperti sudah diketahui Xag M715 adalah mutan Xag YR32 yang telah disisipi transposon mini-Tn5-KmR-TpR. Transposon mini-Tn5-KmR-TpR merupakan turunan dari
23S rRNA 16S rRNA
mini-Tn5-KmR
, suatu transposon komposit yang memiliki stop transkripsi pada kedua batas gen penyandi antibiotik kanamisin (de Lorenzo et al. 1990). Konstruksi plasmid telah dilakukan oleh Rukayadi (1998). Mutagenesis transposon Xag YR32 dilakukan melalui pUTmini-Tn5KmR-TpR (pYR103). Tersisipnya transposon mini-Tn5-KmR-TpR pada kromoson YR32 akan menyebabkan ketidakstabilan transkrip mRNA dari gen yang tersisipi sehingga terjadi pemutusan ikatan fosfodiester pada mRNA. Kemungkinan lain, singkatnya waktu paruh mRNA dapat menyebabkan cepatnya proses degradasi RNA, sehingga jumlah mRNA sangat sedikit. Pada hasil PCR dengan primer 16S rDNA tidak menghasilkan amplikon. Hal ini berarti cDNA yang terbentuk adalah hanya impX, tidak yang lainnya.
1 2 3 4 5 6 7
Gambar 24. Elektroforesis gel agarosa DNA hasil RT-PCR dari RNA total sampel.
Keterangan :
1 = marker DNA ladder (Nugen, Indonesia)
2 = Xag YR32 (RT YR32; PCR dengan primer impX) 3 = Xag M715 (RT M715; PCR dengan primer impX) 4 = kontrol negatif (RT ddH2O; PCR dengan primer impX) 5 = kontrol negatif (RT YR32; PCR dengan primer 16S rDNA) 6 = kontrol negatif (RT M715; PCR dengan primer 16S rDNA) 7 = kontrol positif (pFT3551; PCR dengan primer impX)
Mutagenesis transposon dapat menyebabkan perubahan nukleotida pada posisi menyisipnya transposon. Adanya terminator transkripsi akan menyebabkan berhentinya transkripsi pada situs penyisipan dan bersifat polar. Fenomena ini yang menyebabkan terjadinya perubahan nukleotida dan asam amino yang ditranslasi.
Berdasarkan hasil analisis molekuler, transposon menyisip di gen impXdi bagian C- terminal. Berdasarkan analisis bioinformatika, gen ini menyandikan suatu putative ABC- ATPase yang berperan dalam ekspor molekul toksin dan virulen determinan dari dalam sel ke lingkungannya, dalam hal ini ke inang. Mekanisme ekspor molekul ini sangat tergantung
0,375 kb
0,4 0,7 1,25 kb
energi, dalam hal ini perubahan ATP menjadi ADP dan Pi. ABC transporter juga berperan dalam transportasi molekul ion dari dalam sel ke lingkungan vice versa. Swarts et al. (1998) melaporkan bahwa adanya mutasi tunggal pada H+, K+-ATPase lambung menyebabkan adanya aktivasi konstitutif ATPase. Menurut Tateno et al. (2006), adanya perubahan asam amino C-terminal yang disebabkan oleh mutagenesis pada membran Calsium channel
dapat mempengaruhi lokalisasi protein mem bran. Selain itu, Takazaki et al. (2006) menjelaskan bahwa mutasi pada C-terminal dari transporter anion manusia, mempengaruhi perubahan konformasi protein. Mereka menyimpulkan bahwa C-terminus sangat berperan dalam perubahan konfirmasi protein pada sebagian besar anion transpor. Han et al. (2006) melaporkan bahwa C-terminal dari pori kalium memainkan peran kritis dalam aktivasi dan fungsional pori. C-terminal dari pori ini berimplikasi juga pada lokalisasi dan gerbang pori. Analisis RNA dilanjutkan dengan analisis hibridisasi Northern untuk mengetahui ukuran transkrip impX dan statusnya dalam kromosom terhadap gen lainnya. Hasil hibridisasi Northern dapat dilihat pada Gambar 25. Analisis Northern menunjukkan bahwa transkrip impX berukuran sekitar 0,6 kb. Berdasarkan data di atas, impX merupakan gen yang monosistronik karena ukuran transkrip sama dengan ukuran gen. Data ini sangat mendukung data bioinformatik, bahwa pada impX terdapat terminator atau stop transkripsi sehingga RNA polymerase akan berhenti melakukan transkripsi dan ini yang menyebabkan ukuran transkrip sama dengan ukuran gen. Selain itu, hal ini sangat memungkinkan untuk suatu ABC-ATPase. Ukuran transkrip impX pada Xag M715 sedikit lebih kecil dibandingkan
Xag YR32, karena pada Xag M715 terdapat transposon yang menyisip di C-terminal, sekitar tiga asam amino dari stop kodon. Pada transposon ini terdapat terminator atau stop transkripsi di sekitar awal penyisipan sehingga ukuran transkrip akan berbeda dengan tipe liarnya.
M 1 2 3 4 1 2 3 4
(A) (B)
Gambar 25. Elektroforesis gel agarosa terdenaturasi RNA dan analisis hibridisasi RNA Xag YR32 dan Xag M715.
Keterangan :
(A) elektroforegram RNA YR32 dan M715. B) hibridisasi RNA YR32 dan M715 dengan probe hasil RT-PCR. A dan B) Lajur 1 dan 2 : YR32, lajur 3 dan 4 : M715; lajur M : Marker 1 kb DNA ladder (NEB, USA)
4.6 Uji Komplementasi
Uji komplementasi dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya proses pemulihan sifat mutan non patogenik Xag M715 menjadi patogenik kembali jika diintroduksikan gen yang tersisipi transposon. Pada uji komplementasi ini DNA ukuran 1,3 kb hasil isolasi dengan
inverse PCR disisipkan pada plasmid berspektrum luas pRK415 (10,5 kb) menjadi pRP06 (11,8 kb). Konstruksi plasmid pRP06 yang diintroduksikan pada Xag M715 untuk uji komplementasi dapat dilihat pada Gambar 26.
pRP06 diintroduksikan ke Xag M715 dengan cara konjugasi tiga tetua. Hasil verifikasi plasmid pRP06 yang diisolasi dari E. coli DH5α dan transkonjugan Xag M715 dan dipotong dengan EcoRI dapat dilihat pada Gambar 27. Berdasarkan Gambar 29, maka dapat dipastikan pRP06 sudah masuk ke dalam Xag M715. Hal ini dibuktikan dengan adanya pita ukuran 1,3 kb yang berasal dari Xag YR32. Adanya pi ta-pita lain menunjukkan plasmid endogen. 0,6 1,5 2,9 kb kb
EcoRI EcoRI Ligasi
Gambar 26. Konstruksi plasmid pRP06.
M 1 M 2
(A) (B) Gambar 27. Hasil verifikasi pRP06.
Keterangan :
(A) pRP06 diisolasi dari E. coli DH5α dan dipotong EcoRI;
(B) plasmid diisolasi dari transkonjugan Xag M715 dan dipotong EcoRI M : Marker 1 kb DNA ladder (NEB, USA)
1 : pRP06 dari E. coli DH5α dipotong EcoRI
2 : plasmid dari transkonjugan Xag M715 dipotong EcoRI