Bab III. Metode Analisis Karakteristik Peptida
3.4 Analisis Kadar Peptida
Konsentrasi peptida whey kefir dianalisis menggunakan metode Biuret (Layne, 1957). Sebelum melakukan analisis konsentrasi peptida, terlebih dahulu dipersiapkan kurva standar konsentrasi peptida menggunakan tripton. Standar tripton dibuat dengan berbagai konsentrasi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1 ml ke dalam tabung reaksi. Masing-masing ditambahkan aquadest sampai volume menjadi 4 ml. Selanjutnya ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 6 ml ke dalam masing-masing tabung. Biarkan 10 menit pada suhu ruang sampai terbentuk warna ungu. Kemudian diukur absorbannya dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 540 nm.
sebagai larutan enzyme C dan larutan koenzim.
2. Diambil 2.8 ml larutan enzyme C dan 2.8 ml larutan koenzim, ditambahkan pada larutan indikator.
Penentuan penghambatan ACE dengan kit ACE WST, dilakukan dengan cara, sampel dipipet sebanyak 20 μl dimasukkan dalam lubang microplate reader kemudian ditambahkan 20 μl substrat buffer, dan 20 μl larutan enzyme kerja. Setelah itu diinkubasi 370 C ± 1 jam. Selanjutnya ditambah 200 μl larutan indicator kerja, diinkubasi lagi selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm.
Untuk penentuan blanko 1. Dibuat dengan cara: 20 μl aquadest dimasukkan kedalam lubang microplate reader, ditambah 20 μl substrat buffer dan 20 μl larutan enzyme kerja, diinkubasi pada suhu 370 C ± 1 jam. Kemudian ditambah dengan 200 µl larutan indicator kerja, diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian di baca dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 450 nm.
Penentuan blanko 2, dibuat dengan cara: 40µl aquadest dimasukkan ke dalam lubang microplate
reader dan 20 µl substrat buffer, kemudian diinkubasi pada suhu 370 C ± 1 jam. Ditambah dengan 200 µl larutan indicator kerja, kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan dibaca dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 450 nm. Aktivitas penghambatan ACE, dihitung dengan rumus :
3.4 Analisis Kadar Peptida
Konsentrasi peptida whey kefir dianalisis menggunakan metode Biuret (Layne, 1957). Sebelum melakukan analisis konsentrasi peptida, terlebih dahulu dipersiapkan kurva standar konsentrasi peptida menggunakan tripton. Standar tripton dibuat dengan berbagai konsentrasi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1 ml ke dalam tabung reaksi. Masing-masing ditambahkan aquadest sampai volume menjadi 4 ml. Selanjutnya ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 6 ml ke dalam masing-masing tabung. Biarkan 10 menit pada suhu ruang sampai terbentuk warna ungu. Kemudian diukur absorbannya dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 540 nm.
sebagai larutan enzyme C dan larutan koenzim.
2. Diambil 2.8 ml larutan enzyme C dan 2.8 ml larutan koenzim, ditambahkan pada larutan indikator.
Penentuan penghambatan ACE dengan kit ACE WST, dilakukan dengan cara, sampel dipipet sebanyak 20 μl dimasukkan dalam lubang microplate reader kemudian ditambahkan 20 μl substrat buffer, dan 20 μl larutan enzyme kerja. Setelah itu diinkubasi 370 C ± 1 jam. Selanjutnya ditambah 200 μl larutan indicator kerja, diinkubasi lagi selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm.
Untuk penentuan blanko 1. Dibuat dengan cara: 20 μl aquadest dimasukkan kedalam lubang microplate reader, ditambah 20 μl substrat buffer dan 20 μl larutan enzyme kerja, diinkubasi pada suhu 370 C ± 1 jam. Kemudian ditambah dengan 200 µl larutan indicator kerja, diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian di baca dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 450 nm.
Penentuan blanko 2, dibuat dengan cara: 40µl aquadest dimasukkan ke dalam lubang microplate
reader dan 20 µl substrat buffer, kemudian diinkubasi pada suhu 370 C ± 1 jam. Ditambah dengan 200 µl larutan indicator kerja, kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan dibaca dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 450 nm. Aktivitas penghambatan ACE, dihitung dengan rumus :
3.4 Analisis Kadar Peptida
Konsentrasi peptida whey kefir dianalisis menggunakan metode Biuret (Layne, 1957). Sebelum melakukan analisis konsentrasi peptida, terlebih dahulu dipersiapkan kurva standar konsentrasi peptida menggunakan tripton. Standar tripton dibuat dengan berbagai konsentrasi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1 ml ke dalam tabung reaksi. Masing-masing ditambahkan aquadest sampai volume menjadi 4 ml. Selanjutnya ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 6 ml ke dalam masing-masing tabung. Biarkan 10 menit pada suhu ruang sampai terbentuk warna ungu. Kemudian diukur absorbannya dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 540 nm.
sebagai larutan enzyme C dan larutan koenzim.
2. Diambil 2.8 ml larutan enzyme C dan 2.8 ml larutan koenzim, ditambahkan pada larutan indikator.
Penentuan penghambatan ACE dengan kit ACE WST, dilakukan dengan cara, sampel dipipet sebanyak 20 μl dimasukkan dalam lubang microplate reader kemudian ditambahkan 20 μl substrat buffer, dan 20 μl larutan enzyme kerja. Setelah itu diinkubasi 370 C ± 1 jam. Selanjutnya ditambah 200 μl larutan indicator kerja, diinkubasi lagi selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm.
Untuk penentuan blanko 1. Dibuat dengan cara: 20 μl aquadest dimasukkan kedalam lubang microplate reader, ditambah 20 μl substrat buffer dan 20 μl larutan enzyme kerja, diinkubasi pada suhu 370 C ± 1 jam. Kemudian ditambah dengan 200 µl larutan indicator kerja, diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian di baca dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 450 nm.
Penentuan blanko 2, dibuat dengan cara: 40µl aquadest dimasukkan ke dalam lubang microplate
reader dan 20 µl substrat buffer, kemudian diinkubasi pada suhu 370 C ± 1 jam. Ditambah dengan 200 µl larutan indicator kerja, kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan dibaca dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 450 nm. Aktivitas penghambatan ACE, dihitung dengan rumus :
3.4 Analisis Kadar Peptida
Konsentrasi peptida whey kefir dianalisis menggunakan metode Biuret (Layne, 1957). Sebelum melakukan analisis konsentrasi peptida, terlebih dahulu dipersiapkan kurva standar konsentrasi peptida menggunakan tripton. Standar tripton dibuat dengan berbagai konsentrasi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1 ml ke dalam tabung reaksi. Masing-masing ditambahkan aquadest sampai volume menjadi 4 ml. Selanjutnya ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 6 ml ke dalam masing-masing tabung. Biarkan 10 menit pada suhu ruang sampai terbentuk warna ungu. Kemudian diukur absorbannya dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 540 nm.
Untuk menentukan konsentrasi peptida sampel, dilakukan sama dengan prosedur analisis dilakukan dengan cara yang sama dengan pembuatan standar. Sebelumnya sampel (whey kefir) diultrafiltrasi dengan MWCO ukuran 10 kDa sehingga diperoleh fraksi peptida dengan ukuran lebih kecil dari 10 kDa. Sampel diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan aquadest sampai volume menjadi 4 ml, kemudian ditambah 6 ml pereaksi biuret, dibiarkan 10 menit sehingga berubah warna menjadi ungu dan disesuaikan dengan standar. Diukur absorbansinya dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 540 nm. Konsentrasi peptida diestimasikan terhadap kurva standar tripton. Dengan persamaan garis regresi linier.
3.5 Penentuan IC50 Fraksi Peptida Hasil Fraksinasi
Nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan
persamaan kurva linier antara konsentrasi (µg/ml) dengan aktivitas penghambatan ACE (%), dengan cara memasukkan nilai 50 pada persamaan linier yang diperoleh. Pengukuran dilakukan dengan membuat konsentrasi sampel berseri, seperti 5, 10, 15, 20, 25 dan 30 µg/ml. Dari masing-masing
konsentrasi, dianalisis aktivitas penghambatan ACE fraksi peptida whey kefir.
3.6 Penentuan Profil Asam Amino Kefir
Profil asam amino whey kefir dianalisis menggunakan kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) (Nur et al, 1992). Diawali dengan persiapan larutan stok pereaksi OPA, dengan cara: melarutkan 50 mg OPA ke dalam 4 mL methanol, kemudian ditambahkan 0.025 ml merkaptoetanol dan dihomogenkan. Selanjutnya ditambah secara perlahan-lahan larutan Brij-30 30% sebanyak 0.050 ml dan buffer borat 1 ml. Larutan ini disimpan pada botol berwarna gelap dan stabil selama dua minggu pada suhu 40 C. Pereaksi , berikutnya, yakni pereaksi derivatisasi, dipersiapkan dengan cara, satu bagian larutan stok OPA dicampur dengan dua bagian larutan buffer borat 1M pH 10.4 dengan kestabilan hanya satu hari.
Fase mobil. Pada fase ini terdiri dari bufer A dan B, yang diperlukan untuk mengatur kondisi alat. Bufer A terdiri dari campuran Na asetat 0.025 M, pH 6.5 dan Na. EDTA 0.05 %, methanol 9.0%, THF 1% dilarutkan dalam 1 l aquadest kemudian disaring dengan kertas saring 0.45 mikron dan Untuk menentukan konsentrasi peptida
sampel, dilakukan sama dengan prosedur analisis dilakukan dengan cara yang sama dengan pembuatan standar. Sebelumnya sampel (whey kefir) diultrafiltrasi dengan MWCO ukuran 10 kDa sehingga diperoleh fraksi peptida dengan ukuran lebih kecil dari 10 kDa. Sampel diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan aquadest sampai volume menjadi 4 ml, kemudian ditambah 6 ml pereaksi biuret, dibiarkan 10 menit sehingga berubah warna menjadi ungu dan disesuaikan dengan standar. Diukur absorbansinya dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 540 nm. Konsentrasi peptida diestimasikan terhadap kurva standar tripton. Dengan persamaan garis regresi linier.
3.5 Penentuan IC50 Fraksi Peptida Hasil Fraksinasi
Nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan
persamaan kurva linier antara konsentrasi (µg/ml) dengan aktivitas penghambatan ACE (%), dengan cara memasukkan nilai 50 pada persamaan linier yang diperoleh. Pengukuran dilakukan dengan membuat konsentrasi sampel berseri, seperti 5, 10, 15, 20, 25 dan 30 µg/ml. Dari masing-masing
konsentrasi, dianalisis aktivitas penghambatan ACE fraksi peptida whey kefir.
3.6 Penentuan Profil Asam Amino Kefir
Profil asam amino whey kefir dianalisis menggunakan kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) (Nur et al, 1992). Diawali dengan persiapan larutan stok pereaksi OPA, dengan cara: melarutkan 50 mg OPA ke dalam 4 mL methanol, kemudian ditambahkan 0.025 ml merkaptoetanol dan dihomogenkan. Selanjutnya ditambah secara perlahan-lahan larutan Brij-30 30% sebanyak 0.050 ml dan buffer borat 1 ml. Larutan ini disimpan pada botol berwarna gelap dan stabil selama dua minggu pada suhu 40 C. Pereaksi , berikutnya, yakni pereaksi derivatisasi, dipersiapkan dengan cara, satu bagian larutan stok OPA dicampur dengan dua bagian larutan buffer borat 1M pH 10.4 dengan kestabilan hanya satu hari.
Fase mobil. Pada fase ini terdiri dari bufer A dan B, yang diperlukan untuk mengatur kondisi alat. Bufer A terdiri dari campuran Na asetat 0.025 M, pH 6.5 dan Na. EDTA 0.05 %, methanol 9.0%, THF 1% dilarutkan dalam 1 l aquadest kemudian disaring dengan kertas saring 0.45 mikron dan
Untuk menentukan konsentrasi peptida sampel, dilakukan sama dengan prosedur analisis dilakukan dengan cara yang sama dengan pembuatan standar. Sebelumnya sampel (whey kefir) diultrafiltrasi dengan MWCO ukuran 10 kDa sehingga diperoleh fraksi peptida dengan ukuran lebih kecil dari 10 kDa. Sampel diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan aquadest sampai volume menjadi 4 ml, kemudian ditambah 6 ml pereaksi biuret, dibiarkan 10 menit sehingga berubah warna menjadi ungu dan disesuaikan dengan standar. Diukur absorbansinya dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 540 nm. Konsentrasi peptida diestimasikan terhadap kurva standar tripton. Dengan persamaan garis regresi linier.
3.5 Penentuan IC50 Fraksi Peptida Hasil Fraksinasi
Nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan
persamaan kurva linier antara konsentrasi (µg/ml) dengan aktivitas penghambatan ACE (%), dengan cara memasukkan nilai 50 pada persamaan linier yang diperoleh. Pengukuran dilakukan dengan membuat konsentrasi sampel berseri, seperti 5, 10, 15, 20, 25 dan 30 µg/ml. Dari masing-masing
konsentrasi, dianalisis aktivitas penghambatan ACE fraksi peptida whey kefir.
3.6 Penentuan Profil Asam Amino Kefir
Profil asam amino whey kefir dianalisis menggunakan kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) (Nur et al, 1992). Diawali dengan persiapan larutan stok pereaksi OPA, dengan cara: melarutkan 50 mg OPA ke dalam 4 mL methanol, kemudian ditambahkan 0.025 ml merkaptoetanol dan dihomogenkan. Selanjutnya ditambah secara perlahan-lahan larutan Brij-30 30% sebanyak 0.050 ml dan buffer borat 1 ml. Larutan ini disimpan pada botol berwarna gelap dan stabil selama dua minggu pada suhu 40 C. Pereaksi , berikutnya, yakni pereaksi derivatisasi, dipersiapkan dengan cara, satu bagian larutan stok OPA dicampur dengan dua bagian larutan buffer borat 1M pH 10.4 dengan kestabilan hanya satu hari.
Fase mobil. Pada fase ini terdiri dari bufer A dan B, yang diperlukan untuk mengatur kondisi alat. Bufer A terdiri dari campuran Na asetat 0.025 M, pH 6.5 dan Na. EDTA 0.05 %, methanol 9.0%, THF 1% dilarutkan dalam 1 l aquadest kemudian disaring dengan kertas saring 0.45 mikron dan Untuk menentukan konsentrasi peptida
sampel, dilakukan sama dengan prosedur analisis dilakukan dengan cara yang sama dengan pembuatan standar. Sebelumnya sampel (whey kefir) diultrafiltrasi dengan MWCO ukuran 10 kDa sehingga diperoleh fraksi peptida dengan ukuran lebih kecil dari 10 kDa. Sampel diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan aquadest sampai volume menjadi 4 ml, kemudian ditambah 6 ml pereaksi biuret, dibiarkan 10 menit sehingga berubah warna menjadi ungu dan disesuaikan dengan standar. Diukur absorbansinya dengan spectrophotometer pada panjang gelombang 540 nm. Konsentrasi peptida diestimasikan terhadap kurva standar tripton. Dengan persamaan garis regresi linier.
3.5 Penentuan IC50 Fraksi Peptida Hasil Fraksinasi
Nilai IC50 ditentukan dengan menggunakan
persamaan kurva linier antara konsentrasi (µg/ml) dengan aktivitas penghambatan ACE (%), dengan cara memasukkan nilai 50 pada persamaan linier yang diperoleh. Pengukuran dilakukan dengan membuat konsentrasi sampel berseri, seperti 5, 10, 15, 20, 25 dan 30 µg/ml. Dari masing-masing
konsentrasi, dianalisis aktivitas penghambatan ACE fraksi peptida whey kefir.
3.6 Penentuan Profil Asam Amino Kefir
Profil asam amino whey kefir dianalisis menggunakan kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) (Nur et al, 1992). Diawali dengan persiapan larutan stok pereaksi OPA, dengan cara: melarutkan 50 mg OPA ke dalam 4 mL methanol, kemudian ditambahkan 0.025 ml merkaptoetanol dan dihomogenkan. Selanjutnya ditambah secara perlahan-lahan larutan Brij-30 30% sebanyak 0.050 ml dan buffer borat 1 ml. Larutan ini disimpan pada botol berwarna gelap dan stabil selama dua minggu pada suhu 40 C. Pereaksi , berikutnya, yakni pereaksi derivatisasi, dipersiapkan dengan cara, satu bagian larutan stok OPA dicampur dengan dua bagian larutan buffer borat 1M pH 10.4 dengan kestabilan hanya satu hari.
Fase mobil. Pada fase ini terdiri dari bufer A dan B, yang diperlukan untuk mengatur kondisi alat. Bufer A terdiri dari campuran Na asetat 0.025 M, pH 6.5 dan Na. EDTA 0.05 %, methanol 9.0%, THF 1% dilarutkan dalam 1 l aquadest kemudian disaring dengan kertas saring 0.45 mikron dan
stabil selama 5 hari. Bufer B terdiri dari methanol 95% dalam air dan disaring juga dengan kertas saring Millipore 0.45 mikron.
Analisis profil asam amino, dilakukan dengan cara, whey kefir hasil fermentasi diuapkan dengan vacum evaporator, kemudian diambil whey kefir yang mengandung 3 mg protein dilarutkan dalam 5 ml HCL 0.01N, kemudian disaring dengan kertas saring Millipore 0.45 mikron. Hidrolisat ini diambil 5 ml dan ditambahkan buffer kalium borat pH 10.4 dengan perbandingan 1:1. Larutan ini diambil 5 ml dan ditambahkan 25 µl pereaksi OPA, kemudian didiamkan selama 1 menit untuk sempurnanya proses derivatisasi. Sebanyak 5 µl sampel diinjeksi ke dalam kolom HPLC, kemudian ditunggu 25 menit sampai terjadi pemisahan semua asam amino. Konsentrasi asam amino dalam sampel, dapat dihitung dengan rumus :
3.7 Penentuan Berat Molekul Peptida Dengan Liquid Chromatography Mass Spectro metry- Mass Spectrometry (LCMS-MS)
Penentuan berat molekul fraksi peptida
terpilih (fraksi < 3kDa), dapat diprediksi dengan menggunakan alat LCMS MS (Pratima and Gadikar, 2018) dengan cara: sampel dalam bentuk cair/larutan, disaring dengan filter 0.2 µm dalam botol pial 1 ml. Diambil 5 µl oleh injektor ke dalam alat dengan fase gerak dibawa ke kolom (fase gerak dengan system gradient yaitu tingkat kepolaran bertingkat) yang di baca dengan komputerisasi. Dengan fase gerak, sampel larut dan dibawa ke kolom, kemudian terjadi interaksi antara analit ssampel fase gerak dan fase diam pada kolom. Pada saat ini terjadi pemisahan analit berdasarkan sifat kepolaran. Laturan yang bersifat polar, lebih dahulu keluar sehingga retention time kecil, kemudian yang semi polar atau polar, yang paling terakhir. Setelah terjadi pemisahan pada kolom, akan diperoleh hasil dalam bentuk chromatogram. Dari chromatogram, selanjutnya masuk ke dalam program Masslynk. Analit diionkan oleh ESI yaitu interface yang mengubah fase cair menjadi fase uap ion atau massa ion, kemudian masuk kedetektor. Di detektor mengukur massa ion dengan satuan m/z dalam bentuk spectra. Sebelum massa ion dipecah, stabil selama 5 hari. Bufer B terdiri dari methanol
95% dalam air dan disaring juga dengan kertas saring Millipore 0.45 mikron.
Analisis profil asam amino, dilakukan dengan cara, whey kefir hasil fermentasi diuapkan dengan vacum evaporator, kemudian diambil whey kefir yang mengandung 3 mg protein dilarutkan dalam 5 ml HCL 0.01N, kemudian disaring dengan kertas saring Millipore 0.45 mikron. Hidrolisat ini diambil 5 ml dan ditambahkan buffer kalium borat pH 10.4 dengan perbandingan 1:1. Larutan ini diambil 5 ml dan ditambahkan 25 µl pereaksi OPA, kemudian didiamkan selama 1 menit untuk sempurnanya proses derivatisasi. Sebanyak 5 µl sampel diinjeksi ke dalam kolom HPLC, kemudian ditunggu 25 menit sampai terjadi pemisahan semua asam amino. Konsentrasi asam amino dalam sampel, dapat dihitung dengan rumus :
3.7 Penentuan Berat Molekul Peptida Dengan Liquid Chromatography Mass Spectro metry- Mass Spectrometry (LCMS-MS)
Penentuan berat molekul fraksi peptida
terpilih (fraksi < 3kDa), dapat diprediksi dengan menggunakan alat LCMS MS (Pratima and Gadikar, 2018) dengan cara: sampel dalam bentuk cair/larutan, disaring dengan filter 0.2 µm dalam botol pial 1 ml. Diambil 5 µl oleh injektor ke dalam alat dengan fase gerak dibawa ke kolom (fase gerak dengan system gradient yaitu tingkat kepolaran bertingkat) yang di baca dengan komputerisasi. Dengan fase gerak, sampel larut dan dibawa ke kolom, kemudian terjadi interaksi antara analit ssampel fase gerak dan fase diam pada kolom. Pada saat ini terjadi pemisahan analit berdasarkan sifat kepolaran. Laturan yang bersifat polar, lebih dahulu keluar sehingga retention time kecil, kemudian yang semi polar atau polar, yang paling terakhir. Setelah terjadi pemisahan pada kolom, akan diperoleh hasil dalam bentuk chromatogram. Dari chromatogram, selanjutnya masuk ke dalam program Masslynk. Analit diionkan oleh ESI yaitu interface yang mengubah fase cair menjadi fase uap ion atau massa ion, kemudian masuk kedetektor. Di detektor mengukur massa ion dengan satuan m/z dalam bentuk spectra. Sebelum massa ion dipecah,
stabil selama 5 hari. Bufer B terdiri dari methanol 95% dalam air dan disaring juga dengan kertas saring Millipore 0.45 mikron.
Analisis profil asam amino, dilakukan dengan cara, whey kefir hasil fermentasi diuapkan dengan vacum evaporator, kemudian diambil whey kefir yang mengandung 3 mg protein dilarutkan dalam 5 ml HCL 0.01N, kemudian disaring dengan kertas saring Millipore 0.45 mikron. Hidrolisat ini diambil 5 ml dan ditambahkan buffer kalium borat pH 10.4 dengan perbandingan 1:1. Larutan ini diambil 5 ml dan ditambahkan 25 µl pereaksi OPA, kemudian didiamkan selama 1 menit untuk sempurnanya proses derivatisasi. Sebanyak 5 µl sampel diinjeksi ke dalam kolom HPLC, kemudian ditunggu 25 menit sampai terjadi pemisahan semua asam amino. Konsentrasi asam amino dalam sampel, dapat dihitung dengan rumus :
3.7 Penentuan Berat Molekul Peptida Dengan Liquid Chromatography Mass Spectro metry- Mass Spectrometry (LCMS-MS)
Penentuan berat molekul fraksi peptida
terpilih (fraksi < 3kDa), dapat diprediksi dengan menggunakan alat LCMS MS (Pratima and Gadikar, 2018) dengan cara: sampel dalam bentuk cair/larutan, disaring dengan filter 0.2 µm dalam botol pial 1 ml. Diambil 5 µl oleh injektor ke dalam alat dengan fase gerak dibawa ke kolom (fase gerak dengan system gradient yaitu tingkat kepolaran bertingkat) yang di baca dengan komputerisasi. Dengan fase gerak, sampel larut dan dibawa ke kolom, kemudian terjadi interaksi antara analit ssampel fase gerak dan fase diam pada kolom. Pada saat ini terjadi pemisahan analit berdasarkan sifat kepolaran. Laturan yang bersifat polar, lebih dahulu keluar sehingga retention time kecil, kemudian yang semi polar atau polar, yang paling terakhir. Setelah terjadi pemisahan pada kolom, akan diperoleh hasil dalam bentuk chromatogram. Dari chromatogram, selanjutnya masuk ke dalam program Masslynk. Analit diionkan oleh ESI yaitu interface yang mengubah fase cair menjadi fase uap ion atau massa ion, kemudian masuk kedetektor. Di detektor mengukur massa ion dengan satuan m/z dalam bentuk spectra. Sebelum massa ion dipecah, stabil selama 5 hari. Bufer B terdiri dari methanol
95% dalam air dan disaring juga dengan kertas saring Millipore 0.45 mikron.
Analisis profil asam amino, dilakukan dengan cara, whey kefir hasil fermentasi diuapkan dengan vacum evaporator, kemudian diambil whey kefir yang mengandung 3 mg protein dilarutkan dalam 5 ml HCL 0.01N, kemudian disaring dengan kertas saring Millipore 0.45 mikron. Hidrolisat ini diambil 5 ml dan ditambahkan buffer kalium borat pH 10.4 dengan perbandingan 1:1. Larutan ini diambil 5 ml dan ditambahkan 25 µl pereaksi OPA, kemudian didiamkan selama 1 menit untuk sempurnanya proses derivatisasi. Sebanyak 5 µl sampel diinjeksi ke dalam kolom HPLC, kemudian ditunggu 25 menit sampai terjadi pemisahan semua asam amino. Konsentrasi asam amino dalam sampel, dapat dihitung dengan rumus :
3.7 Penentuan Berat Molekul Peptida Dengan Liquid Chromatography Mass Spectro metry- Mass Spectrometry (LCMS-MS)
Penentuan berat molekul fraksi peptida
terpilih (fraksi < 3kDa), dapat diprediksi dengan menggunakan alat LCMS MS (Pratima and Gadikar, 2018) dengan cara: sampel dalam bentuk cair/larutan, disaring dengan filter 0.2 µm dalam botol pial 1 ml. Diambil 5 µl oleh injektor ke dalam alat dengan fase gerak dibawa ke kolom (fase gerak dengan system gradient yaitu tingkat kepolaran bertingkat) yang di baca dengan komputerisasi. Dengan fase gerak, sampel larut dan dibawa ke kolom, kemudian terjadi interaksi antara analit ssampel fase gerak dan fase diam pada kolom. Pada saat ini terjadi pemisahan analit berdasarkan sifat kepolaran. Laturan yang bersifat polar, lebih dahulu keluar sehingga retention time kecil, kemudian yang semi polar atau polar, yang paling terakhir. Setelah terjadi pemisahan pada kolom, akan diperoleh hasil dalam bentuk chromatogram. Dari chromatogram, selanjutnya masuk ke dalam program Masslynk. Analit diionkan oleh ESI yaitu interface yang mengubah fase cair menjadi fase uap ion atau massa ion, kemudian masuk kedetektor. Di detektor mengukur massa ion dengan satuan m/z dalam bentuk spectra. Sebelum massa ion dipecah,
apakah ada energi rendah (untuk mendapat massa awal analit) atau energi tinggi untuk mendapat fragment analit, kemudian hasil terbaca pada spectrum dengan satuan m/z pada program masslynk. Dengan program ini, dapat diprediksi berat molekul peptida, sehingga diketahui rumus molekulnya. Dari rumus molekul ini, dilanjutkan ke program Chemspidder, untuk memperoleh senyawa dengan rumus bangunnya sehingga diketahui komposisi asam amino penyusun peptida.
BAB IV
KARATERISTIK KEFIR DAN
AKTIVITAS PENGHAMBATAN
SELAMA PENYIMPANAN
Karateristik kefir selama penyimpanan pada suhu 40C dapat dilihat pada Tabel 4.1. dan aktivitas