Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi varietas uwi dari Banggai Kepulauan menggunakan teknik RAPD, untuk berkontribusi pada pengetahuan tentang keragaman genetik dan pemanfaatan yang lebih baik dari potensi genetik tanaman ubi. Bahan penelitian dalam bentuk daun muda dan 38 varietas dan delapan primer. Metode Pelaksanaan dimulai dengan isolasi DNA, amplifikasi PCR, dan analisis data untuk menghasilkan dendrogram hirarkis dengan metode UPGMA program NTSYSpc. Suhu optimum yang terbaik dari penelitian ini 36,3 0C. Delapan primer yang digunakan menghasilkan produk polimorfik. Primer OPW-02, OPP-04, OPP-15 materi penelitian dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok besar. Kelompok I terdiri 6 varietas dan kelompok II terdiri 32 varietas. Berdasarkan koefisien korelasi 0.26 atau perbedaan 74.0 % pada kelompok I dapat dua sub-kelompok yang terdiri dari 4 varietas A dan B sub-sub-kelompok yang terdiri 2 varietas. Kelompok II koefisien korelasi 0.50 atau 50 % perbedaan dapat dua sub-kelompok yang terdiri 22 varietas C, dan D yang terdiri 10 varietas. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa analisis RAPD adalah pendekatan cepat dan berguna untuk membedakan kekerabatan spesies Dioscorea alata dan untuk memperkirakan jarak genetik antara varietas
Kata kunci : PCR, polimorfik, primer, varietas. Abstract
This study aims to characterize the different varieties of yam in Banggai islands used RAPD technique, to contribute to knowledge of the genetic diversity and better utilization of plant genetic yam potential. Research materials in the form of young leaves and 38 varietys of eight primer obtained Implementation method starts with DNA isolation, PCR amplification, and analysis of data to produced a hierarchical dendrogram with the UPGMA method of NTSYSpc program. Temperature optimum the best of this experiment is 36.3 0C. Eight primers used generate polymorphic products, and primer OPW-02, OPP-04, OPP-15 and together showed that there are two major groups in the plant materials used in this study. Group I consisted of 6 varietys and group II consisted of 32 varietys. Based on the correlation coefficient of 0.26 or difference 74.0 % in group I can be two groups. A sub-group consisted of 4 varietys and B sub-sub-group consisting of 2 varietys. Group II correlation coefficient at 0.50 or 50.0 % difference can be two sub-groups consisting of 22 varietys C, and D which consists of 10 varietys. The results of this study showed that RAPD analysis is a rapid and useful approach to distinguish kinship species of Dioscorea alata and to estimate the genetic distance between variety.
Pendahuluan
Uwi merupakan komponen penting dari pertanian di Banggai Kepulauan dan memberikan kontribusi untuk keamanan pangan masyarakat. Selain nilai-nilai ekonomi dan gizi, uwi juga memainkan peran penting dalam kehidupan budaya di Banggai Kepulauan, hal yang sama terjadi di Benin (Zannou et al. 2004, 2007) dan daerah tropis di Amerika dan Asia (Lebot et al. 2005). Ketika melakukan survei kepada para petani kendala yang dihadapi yaitu pemahaman yang benar tentang sifat-sifat genetik dari masing-masing varietas uwi baik yang berkaitan dengan sifat-sifat agronomi maupun sifat fisiologis untuk mengembangkan teknologi adaptif.
Karakterisasi berdasarkan sifat morfologi atau agronomi sangat penting tetapi belum sepenuhnya mengungkapkan informasi genetik yang penting. Teknik molekuler memberi peluang untuk memperoleh penjelasan yang spesifik tentang sifat genetik untuk pengembangan peta genetik, identifikasi variasi dan untuk analisis sifat morfologis dan agronomis penting (Tostain et al. 2002; Tostain et al., 2003; Dumont
et al. 2005). Pemahaman dasar yang benar tentang molekuler dari sisi biologis sangat penting di dalam konservasi, pengelolaan dan pemanfaatan sumber daya genetik tanaman. Secara khusus, pengetahuan yang memadai tentang keragaman genetik dalam populasi tanaman bagi ilmu dasar dan aplikasinya seperti pengelolaan sumber daya genetik. Penilaian keragaman genetik dalam populasi dan antar populasi secara rutin dilakukan pada tingkat molekul dengan menggunakan berbagai teknik seperti analisis DNA di laboratorium untuk mengukur tingkat variasi secara langsung.
RAPD adalah penanda molekuler yang biasa digunakan dalam analisis variasi genetik. Penanda RAPD dihasilkan melalui random amplifikasi DNA genom menggunakan primer pendek (decamers). Penggunaan primer pendek diperlukan untuk meningkatkan peluang menemukan sekuens homolog yang cocok untuk annealing. Kemudian DNA polimorfisme diproduksi untuk "penyusunan kembali dan atau penghapusan situs antara oligonukleotida primer dalam genom mengikat"
Penanda molekuler termasuk RAPD menunjukkan tingkat polimorfisme yang tinggi pada bahan tanaman (Tostain et al, 2003; Kiambi et al, 2005). Penanda RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA) telah terbukti berguna dalam menilai intra-spesifik atau antar-intra-spesifik variabilitas genetik pada banyak spesies tanaman (Katsiotis et al. 2003; Ravi et al. 2003). Menurut Sutrisno (2006) keunggulan dari teknik analisis menggunakan markah RAPD di antaranya adalah (1) kuantitas DNA yang dibutuhkan sedikit, (2) hemat biaya, (3) mudah dipelajari, dan (4) primer yang diperlukan mudah diperoleh. Kelemahan teknik ini antara lain (1) tingkat reproduksibilitas pola markah kecil, (2) sangat sensitif terhadap variasi dalam konsentrasi DNA, dan (3) memerlukan konsentrasi primer dan kondisi siklus suhu yang optimal pada saat pengujian. Penelitian ini menggunakan teknik RAPD, bertujuan menganalisis perbedaan varietas uwi di Banggai Kepulauan untuk memberikan kontribusi pengetahuan keragaman genetik dan penggunaan yang lebih baik dari potensi tanaman uwi.
Bahan dan Metode Waktu dan Tempat
Penelitian dilakanakan bulan Februari 2014 sampai dengan April 2014 di laboratorium Pemuliaan dan Bioteknologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas pertanian IPB, dan Laboratorium Biologi Molekuler FMIPA Universitas Negeri Manado.
Bahan tanaman
Sampel dari 38 varietas uwi dari Kabupaten Banggai Kepulauan Propinsi Sulawesi Tengah yang sudah di introduksi di Manado dan Bogor. Daun muda uwi diekstraksi DNAnya kemudian dianalisis.
Isolasi DNA
Daun uwi muda dan segar digerus dengan mortir dan alu kemudian DNA diisolasi berdasarkan metode CTAB (Doyle, 1987; Rogers dan Bendich 1985) yang dimodifikasi oleh Das et al., (2009). Kurang lebih 200 mg jaringan daun dipindahkan ke tabung Eppendorf 2 ml, dicampur dengan 500 ml 2× ekstraksi CTAB buffer dan diinkubasi dalam water bath 65 °C dengan frekuensi agitasi selama 90 menit. Selanjutnya tabung keluarkan dari water bath dan dibiarkan dingin pada suhu kamar sebelum 500 ml fenol ditambahkan dan dicampur secara menyeluruh. Campuran disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit dan fase supernatan atas dikumpulkan dalam tabung yang baru. Ekstraksi kedua dilakukan dengan 500 ml campuran 24% dari fenol/kloroform dan 1% dari isoamyl alkohol (v/v). Setelah sentrifugasi, supernatan diberi perlakuan dengan RNase dan terakhir dilakukan ekstraksi dengan alkohol isoamyl kloroform. Bagian atas dipindahkan ke dalam tabung baru dan DNA diendapkan dengan volume yang sama 2-propanol dan Na-asetat. Pelet DNA dicuci dengan etanol 70% dan dikeringkan selama 5 menit dalam blok pemanasan pada 60 0C, DNA yang dihasilkan pelet dilarutkan dalam 100 ml air suling dan disterilkan (Sigma). Kualitas DNA diuji, dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1,5%, dan konsentrasi ditentukan dengan spektrofotometer UV. Bagian dari DNA kemudian diencerkan sampai 25 ng ml-1 untuk amplifikasi
PCR.
Amplifikasi PCR
Delapan primer (Tabel 9) yang digunakan dalam penelitian ini diidentifikasi oleh Dansi et al. (2000) sebagai yang terbaik untuk karakterisasi keragaman genetik uwi yaitu primer OPW-2 dan OPW-5, dua primer lainnya OPW-6 dan OPW-8 yang dapat mendeteksi kehadiran D.alata L.(Zannou et al. 2008). Empat primer lainnya dipilih dari publikasi penelitian uwi yaitu primer OPP-04, OPP-15, OPAP-04, dan OPAP-10 mampu menghasilkan empat pola RAPD yang berbeda (Taura Satoru, at al. 2003). Awal percobaan amplifikasi PCR dilakukan pada salah satu dari enam kultivar yang sudah terlebih dahulu diisolasi DNAnya untuk menguji suhu optimal yang dapat mengamplifikasi DNA uwi. Amplifikasi PCR dilakukan terhadap 38 varietas uwi (D. alata). Delapan primer yang digunakan setiap varietas untuk
memilih primer yang mengamplifikasi fragmen polimorfik paling jelas dapat menunjukkan band polimorfik pada 38 kultivar uwi kemudian dipilih untuk penelitian selanjutnya.
Tabel 9. Primer yang mendeteksi kehadiran DNA uwi varietas alata, dan rotundata
Primer Nucleotide sequence
OPW-2 OPW-5 OPW-6 OPW-8 OPP-04 OPP-15 OPAP-04 OPAP-10 5’-ACCCCGCCAA-3’ 5’-GGCGGATAAG-3’ 5’-AGGCCCGATG-3’ 5’-GACTGCCTCT-3’ 5’-GTGTCTCAGG-3’ 5’-GGAAGCCAAC-3’ 5’-CTCTTGGGCT-3’ 5’-CTGGCTTCTC-3’
Reaksi PCR dilakukan dalam volume campuran 25 µl menggunakan KAPA2GTM PCR Kit (Kapa Biosystems Inc., USA) yang campurannya mengandung 5.0 µl 5 x buffer PCR (di dalamnya terkandung 1.5 mM Mg+2 ) 0.5 µl MgCl2 25 mM, 5.0 µl dNTPs 10 mM, 1.0 µl masing-masing primer dengan kosentrasi 10 µM forward dan reverse), 30 ng DNA genom 0.1µl Taq DNA polymerase (5 U µl-1 dan 15.4 µl ddH2O. Proses amplifikasi PCR dilakukan menggunakan mesin GeneAmp® PCR System 2400 (Perkin Elmer). Denaturasi cetakan DNA pada awal reaksi pada suhu 95 0C selama 3 menit , diikuti dengan 45 kali siklus 95 0C selama 10 detik, 57 0
C 10 detik dan 72 0C selama 3 detik, dan diakhiri dengan satu siklus 72 0C selama 10 menit. Produk PCR dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menggunakan elektroforesis gel agarose 1 % pada mesin elektroforesis tegangan 100 V selama 25 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan gel menggunakan ethidium bromide dan visualisasi menggunakan transmulator UV dan dilakukan pemotretan menggunakan camera digital Sony.
Analisis data Molekuler
Setelah pemisahan melaui elektroforesis, fragmen DNA yang teramplifikasi dan terdeteksi pada masing-masing kultivar diberi skor (1), dan untuk yang tidak terdeteksi diberi skor (0) fragmen DNA tertentu pada posisi tertentu kemudian data matriks disiapkan untuk dianalisis. Keragaman genetik di nilai mengikuti Nei dan Li, (1979). Kesamaan matriks pasangan-distance yang dihasilkan menggunakan indeks Nei-Lisimilarity (S = 2NAB/(NA+NB), NAB adalah jumlah fragmen RAPD
bersama dua genotipe atau kultivar (A dan B); NA dan NB adalah jumlah fragmen
RAPD dianalisis pada setiap genotipe.
Kemudian dibangun sebuah dendrogram didasarkan pada data kesamaan matriks menggunakan UPGMA. Rata-rata metode menggunakan analisis klaster NTSYSpc-2.02j (Nilai Taksonomi dan analisis Statistik;. Rohlf, 1998) variasi genetik antara kultivar di analisis menggunakan Analisis Varians Molekuler (AMOVA) varians molekul total dipartisi menjadi komponen varians karena perbedaan antara spesies, komponen varians karena perbedaan antara kelompok dalam spesies, dan perbedaan di antara kultivar dalam kelompok-kelompok di dalam
spesies. Dalam sistem seleksi alam, fluktuasi alel yang terjadi dalam kelompok-kelompok individu cenderung untuk meningkatkan diferensiasi genetik antara kelompok-kelompok karena meningkatnya homozigositas dan menurunnya heterozigositas (Conner dan Hartl, 2004).
Hasil dan Pembahasan Analisis RAPD
Hasil optimasi suhu primer yang dapat mengamplifikasi DNA uwi optimum atau terbaik dari percobaan ini 36.0 0C sesuai dengan yang direkomendasikan untuk tanaman uwi. Berdasarkan pola RAPD delapan primer yang digunakan menghasilkan produk polimorfik. Primer OPW-02 menghasilkan 11 varian yang berbeda OPP-04 menghasilkan 10 varian dan OPP-15 menghasilkan 9 varian yang berbeda. Demikian pula dengan primer OPAP-10 dan primer lainnya dapat menghasilkan produk polimorfik. Polimorfik 38 varietas uwi asal Banggai Kepulauan bisa dibedakan dengan jelas (Gambar 45).
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 L L 21222324 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 L OPW-02 OPW-02 L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 151617181920 L OPP-04 OPP-04 OPP-15 OPP-15
Gambar 45. Hasil amplifikasi DNA uwi menggunakan primer OPW-02, OPP-04 dan OPP-15.
Hasil analisis RAPD menggunakan primer OPW-02, OPAP-10, OPP-04 dan OPP-15 menunjukkan terdapat dua kelompok besar (Gambar 46). Kelompok I beranggotakan 6 varietas dan kelompok II beranggotakan 32 varietas. Kelompok I berdasarkan korelasi koefisien 0.26 atau berbeda 74%, dapat dibagi menjadi 2 sub kelompok A dan B, kemungkinan besar kelompok ini adalah spesies D. rotundata
hal ini ditunjang oleh bentuk umbi uwi sub kelompok A yaitu memanjang dan warna umbinya putih sesuai dengan karakteristik D. rotundata. Namun demikian masih perlu dilakukan penelitian lebih lanjut. Sub kelompok B warna umbinya putih tetapi bentuk umbi pada umumnya bulat kelapa sehingga di Indonesia dikenal sebagai uwi kelapa. Dalam karakterisasi morfologi varietas potil mela dan potil mbol juga membentuk kelompok sendiri.
Kelompok II berdasarkan korelasi koefisien 0.50 atau tingkat perbedaan 50% dibagi menjadi 2 sub kelompok C beranggotakan 22 varietas dan sub kelompok D beranggotakan 10 varietas. Sub kelompok C umumnya berwarna ungu pada nodus, daun muda dan daging umbi. Hal ini sesuai dengan hasil analisi komponen bahwa penentu keragaman terbesar adalah faktor kehadiran pigmen antosianin ungu. Sub kelompok D semuanya berwarna putih dan mempunyai cita rasa enak terutama varietas Balatan, Boan, Solopia dan Pusus.
Hasil analisis klaster penanda RAPD dan penanda morfologi menunjukkan bahwa terdapat perbedaan pola pengelompokan yang terdiri dari dua sampai lima varietas dalam kelompok kecil. Varietas Doso bergabung dengan varietas Banggai, Danggang, Alai dan Salabangga, sedangkan pada pengelompokkan morfologi varietas Doso terpisah dengan kelompok lainnya yang disebabkan karena kehadiran zat antosianin ungu pada bagian batang dewasa dan bentuk umbinya masuk di dalam tiga kategori bentuk umbi uwi bulat, memanjang, dan tidak beraturan seperti pipih dan bercabang. Terdapat enam kelompok kecil yang terdiri dari dua varietas dan satu kelompok yang terdiri dari tiga varietas yang menunjukkan kesamaan antara penanda RAPD dan penanda morfologi masing-masing varietas (Butun 1, Butun 2); (potil Mela, Potil Mbol); (Paupau Ateno, Keat); (Alai, Salabangga); (Sombok Budul, Liboko); (Tombos, Boan mela); dan (Ndolonut, Bunggon, Pusus mela); Masing-masing kelompok kecil ini mempunyai jarak genetik yang sama atau mempunyai hubungan kekerabatan yang sangat erat dan diduga sebagai tanaman yang sama. Di dalam pengelompokkan yang lebih besar terlihat kecenderungan yang sama baik penanda RAPD maupun penanda morfologi banyak ditentukan oleh faktor kehadiran pigmen antosianin ungu pada tanaman uwi. Kelompok yang terdapat antosianin ungu membentuk kelompok yang terpisah dengan kelompok yang tidak terdapat antosianin.
Dendrogram berdasarkan persamaan koefisien similarity dari data RAPD, ditunjukkan pada Gambar 46, spesies uwi asal Banggai Kepulauan dibagi menjadi empat kelompok menurut data RAPD. Kelompok A terdiri dari varietas Butun dan Varietas BDa-02, Mailu, dan Sombok, kelompok B terdiri dari varietas Potil Mela dan Potil Mbol. Kelompok C terdiri dari varietas Banggai, Doso, Alai, Salabangga, Tombos, Paupau Ateno, Keat, Palabatu, Lembet, Lendut, BDa-19, Binda, Ndolonut, Bunggon, BDa-31, Tau, Sombok Budul, Liboko, Kiesi, Maukes, dan Boan Mela. Kelompok D terdiri dari varietas Balatan, Boan Mbol, Kodung, Solopia Patek, Minui, Solopia, Pusus, Lindang, Tinggoi, dan Kasiabang.
Coefficient of Similarity 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1 2 18 20 4 5 3 16 17 15 35 9 25 26 7 11 10 19 6 29 30 31 12 21 27 33 37 13 8 14 24 23 28 22 32 34 36 38
B
C
D
D
B
C
Gambar 46. Pola pengelompokkan varietas uwi Banggai Kepulauan melalui analisis molekuler berdasarkan koefisien similarity.
Keterangan : 1 = Butun; 2 = BDa-02; 3 = Banggai; 4 = Potil mela; 5 = Potil mbol; 6 = Binda; 7 = Palabatu; 8 = Balatan; 9 = Tombos; 10 = Lendut; 11 = Lembet; 12 = Tau ; 13 = Boan mela; 14 = Boan; 15 = Alai; 16 = Danggang; 17 = Doso; 18 = Mailu;19 = BDa-19; 20 = Sombok; 21 = Sombok budul; 22 = Solopia; 23 = Solopia patek; 24 = Kodung; 25 = Paupau ateno; 26 = Keat; 27 = Liboko; 28 = Minui; 29 = Ndolonut; 30 = Bunggon; 31= BDa-31; 32 = Pusus; 33 = Kiesi; 34 = Lindang; 35 = Salabangga; 36 = Tinggoi; 37 = Maukes; 38 = Kasiabag
Penanda molekuler adalah alat fundamental bagi ahli biologi tanaman. Penanda RAPD cocok untuk menentukan kesamaan antara inbrida, membangun filogeni, sidik ragam varietas, penandaan gen yang diinginkan, dan pemetaan genom tanaman. Williams et al. (1990) orang yang pertama menggunakan teknik tersebut pada tanaman dan memberi nama RAPD. Dalam penelitian sebelumnya 34 varietas jelas dapat dibedakan dengan menggunakan studi morfologi yang terdapat di Bab III. Hubungan antara 38 varietas Dioscorea di dalam penelitian ini bisa ditentukan oleh studi RAPD. Dalam beberapa tahun terakhir, teknik berdasarkan molekuler seperti analisis RAPD telah dibentuk dan diterapkan untuk membangun dendrogram filogenetik dari spesies yang terkait erat, untuk menyelidiki hubungan intraspesies,
A
I
dan untuk mengidentifikasi varietas tertentu dari tanaman (Horng-Liang, 2001; Cheng, 1996; Kung,1999; Quellet, 1993). Nilai dan keakuratannya telah diakui secara luas dan teknik ini biasanya rekomendasikan untuk penggunaan praktis.
Polimorfisme yang terdeteksi oleh RAPD ditentukan oleh urutan DNA yang berbeda dari situs primer terikat, atau dengan sisipan dan pemutusan yang terjadi antara situs-situs tersebut. Dalam penelitian ini, polimorfisme tinggi di antara 38 varietas Dioscorea alata yang diteliti diperoleh dengan menggunakan delapan primer. Hasil penelitian menunjukkan cukup tinggi tingkat variabilitas genetik yang ada dalam intraspesies dari Dioscorea alata yang berasal Banggai Kepulauan. Tiga puluh delapan varietas Dioscorea alata diklasifikasikan ke dalam empat sub kelompok berdasarkan data RAPD, dan sama seperti pengelompokkan berdasarkan morfologi. Berdasarkan hasil tersebut terlihat pengelompokkan umumnya berdasarkan warna atau kehadiran pigmen antosianin ungu dibeberapa bagian tanaman seperti di daun muda, urat daun, nodus, tunas muda, pangkal daun, dan daging umbi. Karakter-karakter warna tersebut bersifat tetap dari generasi ke generasi berikutnya, sehingga berdasarkan hal itu maka dapat disimpulkan bahwa warna pada uwi disebabkan oleh faktor genetik.
Simpulan
Hasil analisis RAPD menunjukkan delapan primer yang digunakan dapat mendektesi adanya polimorfisme yang cukup tinggi pada spesies uwi asal Banggai Kepulauan dan enam varietas diantaranya yaitu varietas Butun, BDa-02, Mailu, Sombok, Potil Mela dan Potil Mbol diduga termasuk spesies Dioscorea rotundata,
namun demikian masih perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menyertakan
Dioscorea rotundata sebagai pembanding. Pengelompokan berdasarkan RAPD
diperoleh empat kelompok A, B, C, dan D. Kelompok yang terbentuk terlihat lebih banyak ditentukan oleh warna atau oleh kehadiran pigmen antosianin.
Daftar pustaka
Cheng, KT, Liu SY. 1996. Genetic relationships in Dioscoera alata revealed by RAPD analysis. Chin. Pharm. J. 48: 197–205.
Conner, J. K. and D. L. Hartl. 2004. A primer of ecological genetics. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. http://repositories.lib. texas.edu/ bitstream/handle/2152/ETD-UT-2009-12-447/PANTEL-DISSERTATION.
Das BK, Jena RC, Samal KC. 2009. Optimization of DNA isolation and PCR protokol for RAPD analysis of banana/plantain (Musa spp.). Int. J Agriculture Sci 1 (2) : 21 – 25.
Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A Rapid DNA isolation procedure for small quatities of fres leaf tissue. Phytochem Bull 19: 31 : 11 – 15.
Dumont R, Dansi A, Vernier P, Zoundjihékpon J. 2005. Biodiversité et
domestication des ignames en Afrique de l’Ouest. Pratiques traditionnelles
conduisant á Dioscorea rotundata. Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD) and International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI), Repères, France, p. 120.
Horng-Liang L, Hung-Jen L, Ming-Hue L, Chien-Chih C, Sin-Yie L, Bor-Wen S. 2001. Genetic Identification of Chinese Drug Materials in Yams (Dioscorea spp.) by RAPD Analysis. Journal of Food and Drug Analysis, 9 (3): 132–138 Katsiotis A, Hagidimitriou M, Drossou A, Pontikis C, Loukas M. 2003. Genetic
relationships among species and cultivars of Pistacia using RAPDs and AFLPs. Euphytica 132: 279–286.
Kiambi DK, HJ. Newbury, BV. Ford-Llord, I. Dawson. 2005. Contrasting genetic diversity among Oryza longistaminata (A. Chev et Roehr) proportions from different geographic origins using AFLP. Afr. J. Biotechnol. 4(4): 308–317. Kung, T L., Wu, S T, F S. Thseng. 1999. Variation of plant characteristics of wild
yam Dioscoera pseudojaponica and D. doryophora in Taiwan. Res. Report of Taoyuan District Agriculture Improvement Station, Council of Agriculture, Executive Yuan 37: 1-13.
Lebot V, Ivancic A, Ibrahim K. 2005. The geographical distribution of allelic diversity, a practical means of preserving and using minor root 036 Afr. J. Biotechnol. crop genetic resources. Exp. Agric. 41: 475–489.
Levi A, Thomas CE, Keinath AP, Wehner TC. 2001. Genetic diversity among watermelon (Citrilus lanatus and Citrillus colocynthis) accessions. Gen. Res. Crop Evol. 48: 559–566.
Nei M, Li WH. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76: 5269–5273.
Quellet T, Seifert K A. 1993. Genetic characterization of Fusarium graminearum
strains using RAPD and PCR amplification. Phytopathol. 83: 1003–1007. Ravi M, Geethanjali S, Sameeyafarheen F, Maheswaran M. 2003. Molecular marker
based Genetic Diversity Analysis in Rice (Oryra sativa L.) using RAPD and SSR markers. Euphytica 133: 243–252.
Tostain S, Agbangla C, Daïnou O. 2002. Diversité AFPL des ignames sauvages D. abyssinica et D. praehensilis. Ann. Sci. Agron. Bénin 3(2): 1–20.
Tostain S, C. Agbangla, NM. Baco, FK. Okry, O. Daïnou. 2003. Etude des relations entre ignames sauvages et ignames cultivées (Dioscorea sp.) dans deux
sous-préfectures du Bénin à l’aide de marqueurs AFLP. Ann. Sci. Agron. Bénin 4(1): 1–22.
Williams JGK, Kubelik AR, Livak K J, Rafalaki JA, Tingey SV. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl. Acids Res. 18: 6531–6535.
Zannou A, Ahanchédé A, Struik PC, Richards P, Zoundjihékpon J, Tossou R, Vodouhè S. 2004. Yam and cowpea diversity management by farmers in the Guinea Sudan transition zone of Benin, NJAS–Wageningen J. Agric. Sci. 52(3–4): 393–420.
Zannou A, Tossou RC, Vodouhè S, Richards P, Struik PC, Zoundjihékpon J, Ahanchédé A, Agbo V. 2007. Socio-cultural factors influencing and maintaining yam and cowpea diversity in Benin. Int. J. Agric. Sustainability 5: 140–160.
5 ANALISIS ZAT PATI TANAMAN UWI SEBAGAI