3. METODOLOGI PENELITIAN
3.4. Prosedur Analisis
3.4.1. Analisis kimia (a) Kadar air (AOAC 1995)
3.4. Prosedur Analisis
Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi analisis kimia, analisis mikrobiologi dan uji organoleptik (uji skoring dan uji perbandingan pasangan).
3.4.1. Analisis kimia (a) Kadar air (AOAC 1995)
Prinsip kerja penentuan kadar air adalah mengeringkan bahan dalam oven pada suhu 105-110 0C selama 12 jam atau sampai didapatkan berat konstan. Selisih berat sebelum dan sesudah pengeringan adalah banyaknya air yang diuapkan. Prosedur penentuan kadar air adalah sebagai berikut: cawan porselin kosong dikeringkan pada suhu 105-110 0C selama 15 menit, didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel ditimbang sebanyak 3 g dimasukan ke dalam cawan kosong yang sudah ditimbang beratnya, selanjutnya cawan dan sampel dikeringkan dalam oven bersuhu 105 0C selama 12 jam. Cawan yang sudah didinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang hingga diperoleh bobot konstan. Perhitungan nilai kadar air dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
% 100 x A B) -(A (%) air Kadar =
Keterangan: A = berat sampel awal (g)
B = berat sampel setelah dikeringkan (g)
(b) Kadar protein (Apriyantono et al. 1989)
Prinsip analisis protein adalah pengukuran kadar nitrogen (N) dari sampel
dengan menggunakan Metode Kjeldahl. Cara Kjeldahl digunakan untuk
menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,25 diperoleh nilai protein dalam bahan makanan. Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut:
Sampel ditimbang sebanyak 1-2 g dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl.
30
dimasukkan batu didih. Sampel dididihkan selama 1-1,5 jam sampai cairan menjadi jernih dan didinginkan. Air sebanyak 5-10 ml ditambahkan secara
perlahan-lahan melalui dinding labu Kjeldahl dan didinginkan kembali. Isi labu
dipindahkan ke dalam destilasi kemudian dicuci dan dibilas sebanyak 5-6 kali dengan 1-2 ml air. Air cucian dipindahkan ke dalam alat destilasi. Erlenmeyer yang berisi 5 ml H3BO3 dan 2-4 tetes indikator (campuran metil merah 0,2 % dalam alkohol dan metil biru 0,2 % dalam alkohol) diletakkan di bawah kondensor. Ujung tabung kondensor direndam dalam larutan H3BO3 dan ditambahkan 8-10 ml larutan NaOH-Na2S2O3, kemudian dilakukan destilasi sampai tertampung kurang lebih 15 ml destilat dalam erlenmeyer. Tabung kondensor dibilas dengan air dan bilasan ditampung dalam labu yang sama. Isi labu erlenmeyer diencerkan sampai 50 ml kemudian dititrasi dengan HCl 0,02 N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Kadar protein dihitung dengan rumus: % 100 x sampel mg 6,25 x 14,007 x HCl N x blanko) ml HCl (ml (%) protein Kadar = (c) Nilai pH (Fardiaz 1993)
Sampel ditimbang seberat 2 g, dihancurkan dengan blender lalu didispersikan kedalam 20 ml akuades dan diaduk selama 2 menit. Alat pH meter dikalibrasi dengan menggunakan buffer pH standar (pH 4 dan pH 7) dan selanjutnya elektroda yang telah dibersihkan dicelupkan ke dalam sampel yang akan diperiksa. Nilai pH merupakan hasil pembacaan jarum penunjuk pada pH meter selama 1 menit atau sampai angka digital tidak berubah.
(d) Total Volatile Bases (TVB) (AOAC 1995)
Prinsip penetapan TVB adalah menguapkan senyawa-senyawa volatil yang terbentuk karena penguraian asam-asam amino yang terdapat pada daging ikan. Komponen-komponen utama TVB adalah amine (NH3), Trimethyl amine
(TMA) dan Dimethyl amine (DMA). Prosedur kerjanya adalah sampel ditimbang sebanyak 5 g kemudian dicampur dengan 15 ml TCA 5 % dan diblender, selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring sehingga diperoleh filtrat
jernih. Larutan asam borat sebanyak 1 ml dimasukkan kedalam cawan conway
pada bagian inner chamber kemudian 1 ml sampel yang dianalisis dimasukkan ke dalam outer chamber. Larutan K2CO3 dimasukkan dalam sisi outer chamber
yang berlainan, lalu ditutup rapat (pada bagian tepi cawan sebelumnya diolesi dengan vaselin).
Blanko dibuat dengan prosedur yang sama, tetapi sebagai filtrat sampel diganti dengan TCA 3 %. Cawan ditutup, digoyang selama 1 menit agar tercampur selanjutnya diinkubasi selama 2 jam. Setelah diinkubasi, larutan asam borat pada bagian inner chamber dititrasi dengan HCl 0,01 N hingga berwarna merah muda. Kadar TVB ditentukan dengan rumus sebagai berikut :
15 100 x 14,007 x c x b) -(a g) N/100 (mg TVB = Keterangan :
a = ml titrasi dari sampel b = ml titrasi dari blanko c = ml total volume filtrat
(e) Kadar histamin (SNI 01-2360-1996)
Kadar histamin dianalisis menggunakan alat spektrofotometer. Prinsip pengujian ini adalah histamin diekstrak dari jaringan daging contoh menggunakan metanol dan sekaligus mengkonversi histamin dalam bentuk OH. Zat-zat histamin selanjutnya dimurnikan melalui resin penukar ion dan diubah ke bentuk derivatnya dengan senyawa Orto-ptalatdikarboksildehid (OPT). Besarnya histamin diukur secara fluorometri pada panjang gelombang eksitasi 350 nm dan emisi 444 nm. Pengukuran kadar histamin secara fluorometri terdiri atas beberapa tahapan sebagai berikut:
1). Tahap ekstraksi (preparasi sampel)
Sampel sebanyak 10 g ditimbang kemudian ditambahkan dengan metanol sebanyak 50 ml lalu dihomogenkan dengan homogenizer kurang lebih 1-2 menit. Sampel yang sudah dihomogenkan dipanaskan dalam waterbath pada suhu 60 0C selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Sampel yang sudah didinginkan tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan
32
metanol sampai tanda tera dan dikocok agar homogen. Larutan sampel tersebut kemudian disaring dengan kertas saring Whatman No.01. Hasil saringan tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam erlenmeyer untuk pemurnian (clean up).
2). Persiapan resin
Sebanyak 3 g resin ditimbang untuk setiap kolom dalam beaker glass 250 ml, kemudian ditambahkan 15 ml NaOH 2 N/g resin dan diaduk-aduk dengan magnetik stirer selama 30 menit. Cairan pada bagian atas dituangkan dan diulangi penambahan NaOH dengan jumlah yang sama. Resin selanjutnya dibilas dengan akuades sebanyak 3 kali dan disaring pada kertas saring Whatman No. 01 dan dicuci kembali dengan akuades. Resin harus disiapkan dalam kondisi segar setiap minggu dan disimpan dalam refrigerator.
3). Persiapan kolom resin (tahap clean up/elusi)
Glasswoll dimasukkan dalam kolom resin setinggi kurang lebih 1,5 cm. Resin dimasukkan dalam kolom resin setinggi 8 cm dan volume air yang berada di atas resin dipertahankan kurang lebih 1 cm (diusahakan agar resin jangan sampai kering). Labu takar 50 ml yang sudah berisi 5 ml HCl 1 N diletakkan di bawah kolom resin guna menampung elusi contoh yang dilewatkan pada kolom resin. Hasil tampungan (elusi) tersebut kemudian dipisahkan untuk tahap pembentukan (pembacaan).
4). Pemurnian contoh
Filtrat sebanyak 1 ml dipipet dan dimasukkan dalam kolom resin dan kran kolom resin dalam posisi terbuka dan dibiarkan aliran menetes dalam labu takar 50 ml. Akuades ditambahkan pada saat tinggi cairan kurang lebih 1 cm di atas resin dan cairan dibiarkan berelusi hingga mencapai 50 ml labu takar. Hasil elusi selanjutnya dapat disimpan dalam refrigerator.
5). Persiapan pembacaan contoh, standar dan blanko
Pertama-tama tabung reaksi 50 ml masing-masing untuk contoh, standar dan blanko disiapkan. Masing-masing 5 ml contoh (hasil elusi), standar dan blanko (HCl 0,1 N) dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi tersebut. Selanjutnya ditambahkan berturut-turut 10 ml HCl 0,1 N dan vortex, kemudian
ditambahkan 3 ml NaOH 1 N vortex dan dalam waktu 5 menit harus sudah ditambahkan 1 ml OPT 1 % lalu divortex dan dibiarkan selama 4 menit. Campuran tersebut selanjutnya ditambahkan H3P04 3 N dan divortex. Sampel sesegera mungkin dibaca dengan alat spektrofotometer. Nilai konsentrasi dan fluorosensi dari larutan standar dimasukkan dalam program regresi linier. Nilai fluorosensi contoh dimasukkan ke dalam persamaan regresi standar y= a + bx, dimana y= fluorosensi contoh, a = intercept, b= slope dan x = konsentrasi contoh yang akan dihitung. Konsentrasi histamin dihitung dengan rumus:
(x) sampel bobot fp x b) / a) -(IU (ppm) histamin i Konsentras = Keterangan: IU = intensitas unit a = intercept b = slope x = bobot sampel (g) fp = faktor pengenceran