BAB III METODE PENELITIAN
G. Analisis Hasil
1. Analisis kualitatif
Suatu sistem KCKT yang digunakan dapat untuk menganalisa sampel baik
secara kualitatif maupun kuantitatif. Pengujian secara kualitatif akan menyediakan
informasi tentang keberadaaan suatu analit dalam sampel, dan kuantitatif menghasilkan
data seberapa banyak analit tersebut tersedia dalam sampel. Untuk mengukur analit
dalam sampel, detektor dalam KCKT mengubah konsentrasi atau massa analit yang
terelusi menjadi sinyal listrik. Sinyal listrik ini yang kemudian diplot lawan waktu
menjadi data yang disebut kromatogram. Data dalam bentuk digital ini disajikan
dengan x merupakan waktu dan y merupakan intensitas, yang didapat dari waktu
retensi dan area puncak (Snyder, Kirkland, and Dolan, 2010).
Pada analisis data kualitatif, puncak analit ditentukan dengan waktu retensi (tR),
waktu retensi merupakan waktu analit dideteksi setelah terelusi pada fase diam. Waktu
retensi biasanya dinyatakan dalam menit, namun untuk pengukuran dalam waktu cepat
merupakan jumlah total analit yang dihitung dari awal puncak (peak-start point) hingga
titik akhir puncak (peak-end point) (Snyder, Kirkland, and Dolan, 2010). Untuk
pengukuran kualitatif diukur dengan membandingkan waktu retensi (tR) antara standar
dengan analit (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada analisis data, cara yang paling umum untuk mengetahui jumlah analit
dalam sampel adalah dengan membuat plot kurva kalibrasi dengan menggunakan
standar eksternal. Larutan standar (kalibrator) dibuat dengan konsentrasi yang telah
diketahui dan dibuat plot antara konsentrasi dengan area puncak. Untuk menghitung
analit, dapat dipreparasi dengan cara yang sama. Konsentrasi analit kemudian dihitung
melalui area puncak yang terukur pada kromatogram dengan plot grafik kurva kalibrasi
standar eksternal (Snyder, Kirkland, and Glajch, 1997).
Landasan Teori
Wadah atau pengemas merupakan suatu tempat dimana suatu sediaan
ditempatkan untuk disimpan sebelum digunakan. Pengemas berfungsi melindungi dan
sebagai media pembawa suatu sediaan untuk keperluan tertentu. Wadah terdiri dari
berbagai jenis seperti kaca, plastik, dan lain-lain. Wadah plastik merupakan wadah
yang paling luas penggunaannya. Wadah plastik memiliki beberapa keunggulan
sehingga digunakan untuk berbagai keperluan seperti kuat, jernih, fleksibel, mudah
dibentuk dan memenuhi aspek estetis.
Wadah plastik dapat dibentuk melalui proses polimerisasi dari berbagai
polimer plastik yang luas penggunaannya. Polikarbonat sering digunakan untuk
berbagai keperluan seperti wadah/botol minuman, peralatan otomotif, Compact Disc,
serta peralatan rumah tangga lainnya. Polikarbonat dikenal dengan kode “7” atau kode
“PC” pada lambang daur ulangnya. Polikarbonat dibuat dengan monomer berupa
bisfenol A dan difenil karbonat.
Sinar matahari merupakan beragam gelombang radiasi elektromagnetik yang
dipancarkan oleh matahari dan diterima bumi. Radiasi yang dipancarkan matahari
apabila sampai ke bumi akan melewati atmosfer dan beberapa akan dipantulkan dan
beberapa akan diserap oleh permukaan bumi. Sinar yang diserap oleh bumi akan diubah
menjadi energi panas. Sinar matahari yang diserap bumi akan bervariasi besarnya
bergantung pada tempat atau letak terhadap matahari.
Bisfenol A (2,2-(4,4’-dihidroksifenil) propana) merupakan monomer penyusun plastik jenis polikarbonat dengan kode daur ulang “7”. Seiring penggunaannya, bisfenol A dapat lepas dari polimernya dan terurai membentuk
monomernya kembali. Proses penguraian bisfenol A salah satunya dapat terjadi akibat
peningkatan temperatur, perubahan pH ekstrim, proses polimerasi yang tidak sempurna
serta intensitas sinar ultraviolet yang terdapat pada radiasi sinar matahari. Bisfenol A
yang lepas dari bentuk polimernya dapat terpejan ke manusia dan menimbulkan efek
buruk bagi manusia. Bisfenol A dikenal merupakan bahan berbahaya yang diketahui
tidak hanya mengganggu sistem endokrin tapi juga meningkatkan kerja hormon
esterogen karena strukturnya yang mirip dengan hormon esterogen. Bisfenol A juga
berpengaruh ke janin berupa malformasi, berkurangnya daya hidup dan sebagainya.
Ditinjau dari efek berbahayanya, banyak lembaga menetapakan TDI (Tolerable Daily
Intake) atau dosis harian yang diperbolehkan adalah 0,01 mg/kg/hari (SCF, 2012);
0,025 mg/kg/hari (Health Canada, 2008); 0,05 mg/kg/hari (EFSA, 2013; AIST, 2007).
Penetapan kadar dalam penelitian ini menggunakan instrumen KCKT yang
akan memisahkan suatu senyawa berdasarkan perbedaan kecepatan elusi melewati fase
diam yang dibantu tekanan. Kromatografi ini menggunakan fase diam ODS (C18)
dengan detektor spektroskopi UV. KCKT yang digunakan adalah KCKT fase terbalik
yang akan memisahkan analit dengan waktu tertentu (waktu retensi) kemudian diukur
dengan menggunakan area bawah puncak menggunakan kurva standar eksternal.
E. Hipotesis
1. Sinar matahari berpengaruh terhadap penurunan kadar BPA dalam botol.
2. Dengan semakin lama perlakuan paparan dengan menggunakan radiasi sinar
40 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian dengan rancangan penelitian eksperimental deskriptif karena
diberikan perlakuan pada subjek uji.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel utama
a. Variabel dalam penelitian ini adalah:
1) Lama paparan radiasi sinar matahari
b. Variabel tergantung dari penelitian ini adalah:
2) Kadar BPA yang pada botol air minum
2. Variabel pengacau
a. Variabel pengacau terkendali
1) Kode bertanda “PC” yang terdapat pada kemasan botol air minum 2) Pelarut
b. Variabel pengacau tak terkendali
1) Intensitas paparan radiasi sinar matahari
2) Medium air dalam botol
C. Definisi Operasional
1. Bisfenol A (BPA) merupakan suatu senyawa yang biasa dipergunakan sebagai
monomer untuk pembuatan plastik polikarbonat.
2. BPA yang ditetapkan adalah BPA yang terdapat pada botol air minum.
3. KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) fase terbalik yang digunakan adalah
seperangkat alat KCKT dengan fase diam berupa C18 (oktadesilsilan) dan fase
gerak berupa perbandingan asetonitril dan air (70:30)
4. Kadar BPA dalam wadah ditetapkan dalam satuan µg/g
D. Bahan Penelitian
Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini yaitu baku BPA 97% (E. Merck), metanol pro analysis (E. Merck), Asetonitril pro analysis (E. Merck), dan aquabides. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol minum.
E. Alat Penelitian
Seperangkat alat KCKT fase terbalik merek Shimadzu LC-2010C (pompa merek Shimadzu, detektor UV-Vis merek Shimadzu), kolom oktadesilsilan (C18) merek KNAUER C18 No. 25EE181KSJ (B115Y620) dengan dimensi 250 x 4,6 mm, packing KROMASIL 100-5 C18, seperangkat computer merek Dell B6RDZ1S Connexant Sistem RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S., printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625 730, ultrasonikator merek Retsch tipe T460 No. V935922013 EY, syringe, neraca analitik Ohaus Carat Series PAJ 1003 (max 60/120 g, min 0,001 g, d =
0,01/0,1 mg/s), penyaring milipore, mikropipet Socorex, organik and anorganik solven membran filter Whatman polypropylene backed ukuran pori 0,5 µm dan diameter 47 mm, membran filter Whatman ukuran pori 0,45 µm dan diameter 47 mm, pompa vakum, seperangkat alat gelas (Pyrex)
F. Tata Cara Penelitian 1. Preparasi Sampel
a. Pemilihan sampel. Dipilih sejumlah 20 buah botol air minum yang dibeli dari
supermarket di daerah Maguwoharjo, Sleman, DIY dan dipilih menurut
kesamaan merek, tempat pembelian dan kode recycle (PC).
b. Pengelompokan sampel. Dari sejumlah botol sampel yang dipilih, masing
masing dibagi dalam dua kelompok perlakuan yaitu dengan paparan langsung
radiasi sinar matahari dan sisanya sebagai kontrol (tanpa paparan radiasi sinar
matahari) dengan dua kali replikasi. Lamanya paparan radiasi sinar matahari
yaitu 0; 7; 14; 21; 28 hari dan botol diambil setelah waktu paparan tersebut.
Satu hari paparan diasumsikan sama dengan 7 jam paparan sehingga apabila
sinar matahari tidak mencukupi 7 jam, maka sisa waktunya akan dihitung pada
hari berikutnya, sementara untuk kontrol disimpan dalam tempat gelap dan
2. Pembuatan Larutan Baku BPA
a. Pembuatan latutan stok BPA. Pembuatan larutan stok BPA dilakukan dengan
menimbang 50 mg baku BPA lalu dilarutkan dengan metanol p.a. kedalam
labu takar 25 mL hingga tanda hingga diperoleh konsentrasi 2000 µg/mL.
b. Pembuatan larutan intermediet BPA. Pembuatan larutan intermediet BPA
dilakukan dengan mengambil 0,05 mL larutan stok BPA kemudian dilarutkan
dengan metanol p.a. dalam labu takar 10 mL hingga tanda sehingga diperoleh
konsentrasi 10 µg/mL.
c. Pembuatan seri larutan baku BPA. Larutan baku BPA dibuat dengan seri
larutan baku 1 µg/mL, 1,5 µg/mL, 2 µg/mL, 3 µg/mL, dan 5 µg/mL dibuat
dengan mengambil sebanyak 1 mL, 1,5 mL, 2 mL, 3 mL, dan 5 mL lalu
dilarutkan dengan metanol p.a. kedalam labu takar 10 mL hingga tanda.
3. Ekstraksi BPA dalam sampel
Kemasan air minum dipotong kecil-kecil lalu potongan tersebut diacak
dan diambil 0,250 g. Sampel lalu dilarutkan dalam diklorometan, kemudian aseton
ditambahkan perlahan. Jumlah penambahan diklormetan dan aseton didapatkan
dari hasil optimasi proses ekstraksi, yaitu (1:5) atau diklormetan sebanyak 10 mL
dan aseton 50 mL. Larutan didiamkan selama 10 menit. Supernatan lalu diambil
dengan cara disaring dan dikeringkan dengan menggunakan gas nitrogen lalu
4. Optimasi Proses Ekstraksi
Optimasi proses ekstraksi dilakukan dengan mengoptimasi perbandingan
diklorometan dan aseton dengan membuat tiga perbandingan diklorometan dan
aseton, yaitu diklorometan:aseton (10:50), (50:10), dan (50:50) ditambah standar
adisi sebesar 1 µg/mL sebelum ditambahkannya diklorometan. Ditentukan perbandingan yang paling optimum dengan melihat perolehan kembali (%
recovery) yang terbaik.
5. Efisiensi Ekstraksi Total
Efisiensi ekstraksi dihitung dengan cara membandingkan recovery dari
kadar terukur tiga waktu ekstraksi. Standar adisi ditambahkan pada tiap tahapan
ekstraksi tersebut. Pertama pada saat sebelum ditambah diklorometan, yang kedua
sebelum diuapkan, yang ketiga saat preparasi sesaat sebelum diinjek pada KCKT
lalu dibandingkan recovery-nya dengan 3 kali replikasi. % recovery kadar terukur
pada tiap replikasi kemudian dicari rata-ratanya. Efisiensi penguapan dihitung
dengan melihat perbedaan % recovery waktu kedua dan waktu ketiga, sementara
efisiensi ekstraksi dihitung dengan perbadaan % recovery waktu pertama dengan
yang kedua. Efisiensi ekstraksi total dihitung melalui perbedaan recovery waktu
6. Validasi Proses Ekstraksi dengan Metode Standar Adisi (Standard Addition Method)
Validasi proses ekstraksi dilakukan dengan menghitung akurasi, presisi,
linearitas dan pengaruh proses ekstraksi. Akurasi dinyatakan dengan % recovery
yang dihitung dengan membandingkan konsentrasi adisi dengan konsentrasi
standar sebenarnya. Sampel ditambahkan 5 tingkat konsentrasi adisi yaitu 1
µg/mL, 1,5 µg/mL, 2 µg/mL, 3 µg/mL, dan 5 µg/mL dari baku standar 10 µg/mL
sehingga konsentrasinya setelah diadisi menjadi 1 µg/mL, 1,5 µg/mL, 2 µg/mL, 3
µg/mL, dan 5 µg/mL sebelum diekstraksi (dilakukan 3 kali replikasi). % recovery
dihitung menggunakan rumus :
% recovery = (� −� � �
� � x 100%
Presisi dinyatakan dengan % CV yang menunjukkan persentase
penyimpangan data yang terjadi. Koefisien variasi (CV) dihitung pada setiap
replikasi dengan rumus
% CV = � �
− x 100 %
Linearitas dihitung dengan memplotkan kadar vs AUC untuk
memperoleh persamaan dalam regresi linier y = bx + a, kemudian dihitung nilai r
(linearitas) dari persamaan tersebut.
Pengaruh prosedur ekstraksi diuji dengan menggunakan uji t untuk
membandingkan slope hubungan konsentrasi dan area kurva adisi dengan kurva
tidak. Apabila berbeda signifikan maka dinyatakan prosedur ekstraksi memberikan
pengaruh kepada hasil, sebaliknya apabila hasil menunjukkan tidak berbeda
signifikan maka prosedur ekstraksi tidak memberikan pengaruh terhadap hasil.
7. Injeksi ke dalam Sistem KCKT
Sebanyak 20 µL sampel hasil pemekatan yang telah disaring dengan
milipore serta dibebas-udarakan selama 15 menit diinjeksikan ke sistem KCKT
fase terbalik dengan detektor pada panjang gelombang 278 nm, flow rate 1
mL.menit-1, dan fase gerak asetonitril:air (70:30) LOD 0,0471 µg/mL, LOQ 8,4701 µg/g dan rentang 0,3-5 µg/mL (Natasia, 2013).
G. Analisis Hasil 1. Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi (tR)
pada kromatogram yang didapatkan dari sampel dengan waktu retensi (tR) dari
senyawa baku BPA dan membandingkan sejumlah sampel konsentrasi bertingkat
(adisi) dengan masing-masing puncaknya.
Dari hasil puncak yang dibandingkan, resolusi sampel dihitung untuk
melihat apakah sampel berhasil diekstraksi dengan baik dan terpisah dari puncak
pengotor lainnya. Resolusi dihitung menggunakan rumus :
Rs = 2(Δ (W−W2
