Telah diketahui bahwa kromatografi merupakan salah satu cara pemisahan yang berdasarkan pada perpindahan yang disertai perbedaan laju gerak komponen yang akan dipisahkan. Dengan demikian dapat dimengerti bahwa waktu retensi (tR) tiap komponen adalah karakteristik pada suatu kondisi kromatografi tertentu. Secara teoritis, berdasarkan nilai waktu retensi yang karakteristik ini maka kromatografi dapat digunakan untuk keperluan analisis kualitatif suatu campuran tak diketahui. Akan tetapi pada prakteknya tidak demikian. Metoda kromatografi tak dapat digunakan untuk analisis kualitatif dari suatu campuran yang sama sekali belum diketahui. Yang dapat dilakukan antara lain adalah dengan membandingkan kromatogram, jadi juga waktu retensi, dari campuran yang tak diketahui dengan suatu kromatogram yang diperoleh dengan menyuntikkan komponen-komponen standar yang telah diketahui dengan pasti. Berikut ini diberikan contoh langkah-langkah yang dapat digunakan untuk analisis kualitatif. Jika terdapat zat A dan B yang tak diketahui sedang zat C telah diketahui dengan pasti dan diduga A atau B tersebut adalah zat C, maka langkah pertama yang dilakukan adalah dengan membuat kromatogram campuran zat A dan B. Kromatogram yang dihasilkan tentu saja akan menghasilkan dua puncak yakni puncak A dan B. Langkah berikutnya adalah menambahkan zat C yang telah diketahui pada campuran A dan B lalu dibuat kromatogramnya. Kromatogram yang dihasilkan akan memberikan beberapa kemungkinan seperti berikut ini.
A B A B+C A B C
Kemungkinan I.
Dari kromatogram yang diperoleh, dihasilkan dua puncak dengan waktu retensi yang sama dengan kromatogram campuran A + B, hanya saja salah satu puncak membesar sedang yang lainnya mengecil. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa zat B “kemungkinan” sama dengan zat C, karena waktu retensinya sama dan adanya zat C memperbesar puncak B.
Kemungkinan II
Dari kromatogram yang diperoleh, terdapat tiga puncak dengan waktu retensi berlainan. Disini, dengan “pasti” dapat dikatakan bahwa zat A dan B bukanlah zat C.
Untuk keperluan analisis kualitatif sering juga digunakan besaran waktu retensi relatif (Relative Retention Time, RRT). Waktu retensi relatif ini adalah waktu retensi suatu komponen dibandingkan dengan waktu retensi komponen lainnya yang dianggap sebagai pembanding atau standar. Seperti halnya pada cara analisis kualitatif yang telah diberikan diatas, pada cara ini juga ditambahkan zat pembanding tetapi yang diketahui dengan pasti waktu retensinya tidak sama dengan waktu retensi dari komponen-komponen yang ada di dalam campuran.
Mula-mula campuran yang mengandung A dan B dikromatografi kemudian campuran ini ditambah zat standar dan juga dibuat kromatogramnya. RRT dihitung sebagai perbandingan waktu retensi terkoreksi dari suatu komponen dengan waktu retensi terkoreksi dari komponen yang dijadikan sebagai standar.
A B
to to
A B
C
Kromatogram campuran A+B Kromatogram A+B dan Standar C
Dari kromatogram di atas dapat dihitung RRT untuk masing-masing komponen.
RRT A = (tRA – to)/ (tRC – to) RRT B = (tRB – to)/ (tRC – to) RRT C = (tRC – to)/ (tRC – to) = 1
Contoh penggunaan RRT dapat dilihat seperti berikut ini.
Dalam analisis campuran A, B dan C yang diperkirakan mengandung n-oktana, tr untuk zat A = 15,5 mm, B = 17 mm, dan C = 62 mm. Jika kedalam campuran ini ditambahkan iso-oktana sebagai standar, diperoleh puncak baru dengan tr = 47 mm dan t0
= 2 mm.
RRT dari n-oktana terhadap iso-oktana (tr n-oktana/tr iso-oktana) adalah 0,33.
RRT A = (15,5 - 2)/(47 - 2) = 0,30 RRT B = (17,0 - 2)/(47 - 2) = 0,33 RRT C = (62,0 - 2)/(47 - 2) = 1,33
Dari hasil perhitungan RRT di atas dapat dikatakan bahwa senyawa B adalah n-oktana karena nilai RRT-nya sama.
Penggunaan RRT untuk analisis kualitatif jauh lebih baik dibanding penggunaan waktu retensi saja karena dengan cara ini dapat
dieliminasi beberapa kesalahan yang mungkin timbul, seperti : berubahnya parameter-parameter dalam kolom.
Sebagai standar dalam dapat dipilih salah satu dari daftar yang diakui secara internasional yang dikeluarkan oleh IUPAC. Beberapa diantaranya diberikan dalam tabel berikut.
td (0C) senyawa Apiezon-L Carbowax 20 M -0,5 n-butana 1,9 0,6 80,1 benzena 11,4 10,2 99,2 iso-oktana 4,3 3,0
Standar yang dipilih bergantung pada volume retensi atau waktu retensi komponen yang akan dianalisis. Juga bergantung pada kereaktifannya terhadap komponen cuplikan dan fasa diam. Ini berarti standar tak boleh berekasi baik dengan fasa diam maupun dengan komponen ciplikan dan juga puncaknya terletak berdekatan dengan komponen yang akan dianalisis.
Waktu retensi relatif suatu zat terhadap suatu zat standar akan berubah bila fasa diam dari kolom berubah atau berlainan.
Untuk mempermudah pemilihan standar dalam, E. Kovats telah menyusun suatu sistem indeks yang didasarkan pada senyawa alkana sebagai standar. Senyawa alkana dipakai sebagai standar karena inert dan larut dalam kebanyakan fasa diam yang digunakan dalam kromatografi gas. Indeks yang disusun ini disebut sebagai INDEKS KOVATS (I).
z
R
R
R
R
n
I
z
n
z
z
x
log
log
log
log
100
dimana: RX = tR untuk senyawa XRZ = tR untuk senyawa n-alkana dengan z buah atom C RZ+n = tR untuk senyawa n-alkana dengan z+n buah atom C
n = selisih antara jumlah atom C senyawa alkana normal bersangkutan
Dari nilai I, dapat diramalkan urutan-urutan terelusinya komponen dari kolom (orde elusi). Secara umum diperoleh bahwa komponen dengan jumlah atom C paling kecil yang akan terelusi lebih awal sedang komponen dengan jumlah atom C paling besar akan terelusi paling alhir.
Contoh pemakaian indeks Kovats.
Untuk fasa diam Apiezon-L diketemukan nilai-nilai I pada 160 0C seperti berikut ini.
campuran 2 komponen standar dalam IUPAC n-oktana (td. = 1260C) etil-benzena (td. = 1360C) benzena (td. = 800C) p-xylena (td. = 1300C) sikloheksan a (td. = 1550C) I = 810 I = 920 I = 704 I = 926 I = 894
Jika ingin dilakukan pengukuran waktu retensi relatif (RRT) dari campuran n-oktana + etilbenzena dengan menggunakan salah satu dari ketiga standar diatas maka zat standar dalam yang paling baik adalah syandar dengan indeks Kovats terletak antara 810 – 920 yaitu sikloheksana dengan nilai I = 894.
Berdasarkan atas nilai-nilai I yang diberikan di atas maka puncak sikloheksana akan terletak diantara puncak n-oktana dan etil-benzena. Prinsipnya adalah bahwa zat dengan I paling kecil akan terelusi paling awal sedang zat dengan I terbesar akan terelusi paling akhir.
Perlu diketahui bahwa jika fasa diam diubah maka nilai indeks Kovats suatu zat juga akan berubah. Jika digunakan Carbowax 20M pada suhu yang sama seperti di atas (1600C) maka nilai indeks Kovats dari n-oktana=800, etil-benzena=1176, benzena=979, p-xylen=1180 dan untuk sikloheksanon=1361. Pada kondisi kromatografi seperti ini, maka untuk pengukuran RRT dari n-oktana dan etil-benzena tak dapat lagi digunakan sikloheksana karena
indeks Kovatnya tidak lagi terletak antara indeks Kovats kedua senyawa yang akan ditentukan RRT-nya. Untuk keperluan ini maka yang dapat digunakan sebagai standar dalam adalah benzena dengan nilai I = 979.