3. METODOLOGI PENELITIAN
3.4. Prosedur Analisis
3.4.2. Analisis mikrobiologi
ditambahkan 3 ml NaOH 1 N vortex dan dalam waktu 5 menit harus sudah ditambahkan 1 ml OPT 1 % lalu divortex dan dibiarkan selama 4 menit. Campuran tersebut selanjutnya ditambahkan H3P04 3 N dan divortex. Sampel sesegera mungkin dibaca dengan alat spektrofotometer. Nilai konsentrasi dan fluorosensi dari larutan standar dimasukkan dalam program regresi linier. Nilai fluorosensi contoh dimasukkan ke dalam persamaan regresi standar y= a + bx, dimana y= fluorosensi contoh, a = intercept, b= slope dan x = konsentrasi contoh yang akan dihitung. Konsentrasi histamin dihitung dengan rumus:
(x) sampel bobot fp x b) / a) -(IU (ppm) histamin i Konsentras = Keterangan: IU = intensitas unit a = intercept b = slope x = bobot sampel (g) fp = faktor pengenceran 3.4.2. Analisis mikrobiologi
(a) Total mikroba/ Total Plate Count (TPC) (Fardiaz 1993)
Analisis TPC bertujuan untuk menentukan secara kuantitatif jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada media Plate Count Agar (PCA). Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut: sebanyak 1 ml contoh dilarutkan ke dalam 9 ml larutan garam fisiologis steril sehingga didapatkan pengenceran 10-1. Larutan tersebut dipipet 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi 9 ml larutan fisiologis steril untuk mendapatkan pengenceran 10-2, demikian seterusnya sampai pengenceran 10-5. Masing-masing pengenceran dipipet 1 ml dan dipindahkan ke dalam cawan petri steril, selanjutnya setiap pengenceran dipindahkan ke dalam 2 cawan petri steril (duplo). Kemudian ke dalam setiap cawan petri ditambahkan 15 ml media Plate Count Agar (PCA) dan cawan petri digoyang supaya media benar-benar merata dan setelah media membeku, cawan petri disimpan dengan posisi terbalik di dalam inkubator pada suhu 37 °C selama 48 jam.
34
Cara perhitungan hasil analisis TPC sebagai berikut: cawan yang dipilih
dan dihitung jumlah bakterinya adalah yang mengandung koloni antara 30-300. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari 2 angka, yaitu angka pertama
dan angka kedua menghasilkan koloni kurang dari 30, maka jumlah koloni yang dihitung hanya pada pengenceran yang terendah. Jika semua pengenceran menghasilkan lebih dari 300 koloni, maka hanya jumlah koloni tertinggi yang dihitung. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni antara 30-300 koloni dan perbandingan hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut kurang dari atau sama dengan dua, maka kedua nilai tersebut dirata-ratakan dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari atau sama dengan dua maka yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil. Apabila menggunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, maka data yang diambil adalah dari kedua cawan petri tersebut. Perhitungan jumlah koloni menggunakan rumus sebagai berikut:
(b) Total kapang (Fardiaz 1993)
Prosedur analisis total kapang sama dengan prosedur analisis pada TPC, hanya media yang digunakan untuk total kapang adalah Potatoes Dextro Agar
(PDA).
(c) Escherichia coli (SNI 01-2332.1- 2006)
Prinsip kerja dari pengujian Escherichia coli adalah menumbuhkan bakteri dalam suatu media cair dan perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Prosedur kerja pengujian E. coli adalah sebagai berikut:
Faktor pengeceran Total mikroba (Cfu/g) = Jumlah koloni per cawan x 1
1). Preparasi contoh
Prosedur kerjanya sebagai berikut: contoh sebanyak 25 ml yang akan diuji dipipet, kemudian dimasukkan ke dalam wadah plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan Butterfield’s Phosphatase Buffered (BPB), selanjutnya dihomogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 10-1.
2). Uji pendugaan coliform
Pertama-tama disiapkan pengenceran 10-2 dengan cara melarutkan 1 ml larutan 10-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer BPP. Pengenceran dilakukan sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh dan setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Sampel selanjutnya dipindahkan dengan menggunakan pipet steril sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung Lauryl Tryptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham selanjutnya diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 0C. Gas yang terbentuk (positif) setelah inkubasi 24 jam diperhatikan, selanjutnya tabung-tabung yang negatif (tidak adanya gas) diinkubasikan kembali selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
3). Uji penegasan coliform
Tabung-tabung Lauryl Tryptose Broth (LTB) yang positif diinokulasikan kedalam tabung-tabung Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB) yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. Tabung-tabung BGLBB yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 0C. Tabung-tabung BGLBB yang menghasilkan gas diperiksa dan dipisahkan. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Jumlah tabung-tabung BGLBB yang positif ditentukan berdasarkan Angka Paling Memungkinkan (APM) dan dinyatakan sebagai APM/g coliform.
4). Uji pendugaan E. coli
Tabung LTB yang positif diinokulasi ke tabung-tabung Escherichia coli Broth (ECB) yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. ECB kemudian diinkubasi dalam waterbath selama 48 jam pada suhu 45 0C. Waterbath
36
harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi. Tabung-tabung ECB yang menghasilkan gas selama 24 jam diperiksa, dan jika negatif maka diinkubasi kembali sampai 48 jam. Tabung yang positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Jumlah tabung-tabung BGLBB yang positif ditentukan berdasarkan Angka Paling Memungkinkan (APM) dan dinyatakan sebagai APM/g faecal coliform.
5). Uji penegasan E. coli
Tabung-tabung ECB yang positif digoreskan ke Levine’s Eosin Methylene Blue Agar (L-EMBA) menggunakan jarum ose, lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 0C. Koloni E. coli terduga memberikan ciri yang khas yaitu hitam pada bagian tengah tanpa hijau metalik. Koloni yang diduga E. coli
kemudian diambil lebih dari satu koloni dari masing-masing cawan L-EMB lalu digoreskan ke media Plate Count Agar (PCA) miring dengan menggunakan jarum tanam, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 0C.
6). Uji morfologi
Uji morfologi dilakukan dengan cara pewarnaan Gram dari setiap koloni yang diduga sebagai E. coli. Biakan/contoh diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama 24 jam kemudian dilanjutkan dengan pengamatan Gram bakteri menggunakan mikroskop sehingga dapat diketahui bahwa E. coli termasuk bakteri Gram-negatif, berbentuk batang pendek.
(d) Salmonella (SNI 01-2332.2- 2006)
Prinsip kerja dalam pengujian Salmonella adalah contoh yang diuji ditumbuhkan terlebih dahulu pada media pengkayaan kemudian dideteksi dengan menumbuhkannya pada media agar selektif. Metode ini didasarkan pada pengujian dengan menggunakan media pengkayaan. Koloni-koloni yang diduga
Salmonella (suspect colonies) pada media selektif diisolasi dan dilanjutkan dengan konfirmasi melalui uji biokimia dan uji serologi untuk meyakinkan ada atau tidaknya bakteri Salmonella. Prosedur kerja pengujian Salmonella adalah sebagai berikut :
1). Prapengkayaan
Sampel sebanyak 25 g atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang akan diuji, kemudian dimasukkan dalam wadah plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan Lactose Broth (LB). Contoh kemudian dihomogenkan selama 2 menit untuk dianalisis dan secara aseptis larutan contoh dipindahkan dalam wadah steril yang sesuai dan dibiarkan pada suhu ruang selama 60 menit dengan wadah tertutup. Sampel dikocok perlahan-lahan dan bila perlu nilai pH ditetapkan sampai 6,6, kemudian dikocok secara merata dan tutup wadahnya dikendurkan secukupnya. Sampel kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 0C.
2). Pengkayaan
Contoh dipindahkan sebanyak 0,1 ml kedalam 10 ml Rappaport-Vassilladis (RV) medium dan 1 ml larutan contoh kedalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB). Media pengkayaan selektif kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 43 0C (waterbath).
3). Isolasi Salmonella
Tabung medium RV dan TTB yang sudah diinkubasi dihomogenkan dengan vortex dan menggunakan jarum loop, kemudian digoreskan RV yang telah diinkubasi ke dalam media pertumbuhan Salmonella yaitu Hectoen EntericAgar
(HEA), Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLDA) dan Bismuth Sulfit Agar
(BSA). Hal yang sama dilakukan untuk contoh yang sudah diinkubasi dalam media TTB kemudian digoreskan pada media HEA, XLDA dan BSA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 0C.
4). Pengamatan morfologi koloni Salmonella yang khas (typical)
Koloni Salmonella dari masing-masing media agar selektif setelah diinkubasi 24 jam kemudian diambil 2 atau lebih koloni. Koloni-koloni
Salmonella yang khas adalah pada HEA, koloni berwarna hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni berwarna hitam. Media XLDA, koloni berwarna merah jambu (pink) tanpa inti hitam. Kultur
