V. HASIL PENELITIAN
6.2. Analisis RAPD Nilam
Asam deoksiribonukleat (DNA) genom dari daun nilam telah berhasil diisolasi. Isolasi DNA dari sample merupakan langkah awal semua jenis pengujian dengan menggunakan penanda molekuler. Menurut Sanjaya dkk., (2002) penanda molekuler seperti marka DNA merupakan alat yang sesuai untuk
menentukan jarak genetik, karena marka yang polimorfik dapat diperoleh lebih cepat dan lebih banyak dari pada penanda morfologi.
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) adalah suatu sistem deteksi molekuler yang berbasis PCR, salah satu teknik molekuler untuk mendeteksi keragaman DNA didasarkan pada penggandaan DNA. RAPD merupakan penanda DNA yang memanfaatkan primer acak oligonukleotida pendek (dekamer) untuk mengamplifikasi DNA genom organisme (Bardakci, 2001; Sharma et al. 2008).
Amplifikasi DNA tergantung dari kecocokan primer dengan sekuen DNA nilam. Primer yang tidak sesuai dengan sekuen DNA nilam tidak menghasilkan produk amplifikasi. Hal ini disebabkan karena tidak terdapat situs yang komplementer pada DNA nilam dengan sekuen primer tersebut.
Menurut Yuwono (2006) primer yang tidak spesifik dapat menyebabkan teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang tidak dijadikan sasaran atau sebaliknya tidak ada daerah genom yang teramplifikasi. Disamping ditentukan oleh ada tidaknya situs penempelan primer, keberhasilan teknik ini ditentukan juga oleh kemurnian dan keutuhan DNA cetakan (Bardakci, 2001). Menurut Caetano-Anollés (2004) untuk beberapa genom, kemurnian dari sample DNA tidak mempengaruhi reaksi amplifikasi. Konsentrasi DNA genom merupakan faktor terpenting dalam reaksi amplifikasi. Konsentrasi DNA yang terlalu tinggi dapat meningkatkan kontaminan yang mengganggu reaksi amplifikasi (Chen, 2000). Faktor lain yang menentukan keberhasilan reaksi PCR adalah kecocokan primer dalam membentuk ikatan komplementer dengan DNA sampel (Caetano-Anollés, 2004).
Primer yang sesuai dapat membedakan antara nilam Jawa dan nilam Aceh. Hal ini sejalan dengan hasil amplifikasi primer UBC 250 yang menghasilkan pita DNA unik dengan ukuran sekitar 400 bp yang hanya muncul pada nilam Jawa. Menurut Roberts (1993) primer RAPD biasanya mampu mengamplifikasi DNA dengan ukuran 100 bp sampai 3000 bp tergantung DNA genom dan primer.
Tingkat keinformatifan dari primer (PIC) berkisar dari 0,68 – 0,87 yang artinya primer tersebut dapat mendeteksi polymorphisme dalam suatu populasi sebesar 68 – 87%. Semakin besar nilai PIC suatu primer maka primer tersebut semakin baik untuk dipakai sebagai penanda molekuler. PIC mengacu pada nilai suatu penanda untuk mendeteksi polymorphisme di dalam suatu populasi. PIC tergantung pada banyaknya dapat ditemukan allel dan distribusi dari frekwensinya (Anderson et al. (1993).
6.3. Analisis Filogeni Nilam
Analisis filogeni menunjukkan bahwa dengan primer OPA 04, OPD 11, OPD 14 dan UBC 250, nilam yang dibudidayakan di beberapa daerah di Bali dapat dikelompokan. Nilam yang dibudidayakan di daerah Pupuan, Nungnung, Mekar Sari dan Mengwi berada dalam satu kelompok dengan jarak genetik 0,043 – 0,130. Sedangkan nilam Sidan dan Abiansemal yang berada dalam satu kelompok memiliki jarak genetik 0.087. Kedua kelompok tersebut lebih mirip dengan nilam Lhokseumawe (jarak genetik 0,087- 0,130), dibandingkan dengan nilam Tapak Tuan (jarak genetik 0,174 – 0,304) dan Sidikalang (jarak genetik 0.174 - 0,261). Namun secara filogeni tanaman nilam tersebut berada diluar kelompok Lhokseumawe. Nilam di daerah Lemukih dan daerah Plaga berada dalam satu kelompok serta memiliki jarak genetik 0,087 dengan nilam Tapak
Tuan dan Lhokseumawe. Nilam yang dibudidayakan di Wanagiri dan di Jegu memiliki kemiripan dengan nilam Sidikalang dengan jarak genetik 0,130. Nilam yang dibudidayakan di daerah Belok mirip dengan nilam yang dibudidayakan di daerah Lukluk dengan jarak genetik 0,174. Kedua nilam ini memiliki jarak genetik 0,217 – 0,304 dengan nilam Lhokseumawe, Sidikalang dan Tapak Tuan.
Dari Gambar 5.6 terlihat bahwa nilai bootstrap dari pengelompokan nilam yang diuji relatif rendah. Hal ini disebabkan karena primer yang dipergunakan terbatas. Untuk mendapatkan hasil pengelompokan yang lebih baik dengan nilai bootstrap yang tinggi perlu dilakukan pengujian dengan menggunakan primer yang lebih banyak. Menurut Holmes (2005) makin tinggi nilai bootstrap makin baik.
Secara molekuler nilam yang dibudidayakan di Bali memiliki kemiripan dengan nilam Aceh dengan jarak genetik dari 0,087 - 0,304 dibandingkan jarak genetik dengan nilam Jawa sebesar 0,652. Rentang jarak genetik menunjukan keragaman genetik tanaman nilam yang diuji. Menurut Hasan et al. (2009) rentang jarak genetik yang tinggi dari sampel mengindikasikan tingginya keragaman antar individu dalam suatu wilayah.
Cabang pada pohon filogeni mewakili hubungan antar unit yang menggambarkan hubungan keturunan dengan leluhur, sedangkan panjang cabang menggambarkan jumlah perubahan evolusioner yang terjadi antara dua nodus (Li dan Graur, 1991).
Adanya keragaman genetik nilam yang dibudidayakan di beberapa wilayah di Bali mencerminkan sumber bibit yang ditanam tidak berasal dari induk yang sama. Keragaman genetik nilam antar wilayah dengan ketinggian berbeda
tidak konsisten. Hal ini menjelaskan bahwa keragaman tersebut tidak disebabkan oleh perbedaan tempat pembudidayaan di Bali, tetapi lebih disebabkan karena perbedaan sumber bibit atau varietas. Hal ini sesuai dengan informasi dari sejumlah petani dan pedagang bibit nilam yang ada di Bali, dimana nilam yang dibudidayakan di daerah Pupuan, Nungnung, Mekar Sari dan Mengwi sumber bibitnya berasal dari daerah Jogjakarta. Demikian juga dengan nilam Sidan dan Abiansemal. Nilam di daerah Lemukih, daerah Plaga, Wanagiri dan Jegu berasal dari Bogor. Nilam yang dibudidayakan di daerah Belok dan Lukluk berasal dari Jawa Timur.
Keragaman genetik nilam ini bisa timbul karena adanya mutasi alami akibat cekaman lingkungan dari tempat asal bibit nilam tersebut. Keragaman genetik tanaman nilam berpengaruh terhadap beragamnya produktivitas tanaman nilam dalam menghasilkan minyak atsiri. Menurut Nuryani (2006a) Tapak Tuan unggul dalam produksi dan kadar patchouli alkohol. Lhokseumawe kadar minyaknya tinggi sedangkan Sidikalang toleran terhadap penyakit layu bakteri dan nematoda.
Keragaman genetik dapat terjadi karena mutasi dan persilangan. Mutasi pada tanaman dapat terjadi secara spontan di alam (spontaneous mutation) dan dapat juga terjadi melalui induksi (induced mutation). Tanaman nilam Aceh umumnya diperbanyak secara vegetatif, sehingga keragaman genetiknya hanya mengandalkan adanya mutasi alam.
Mutasi alami terjadi secara lambat. Faktor luar yang secara alami merangsang terjadinya mutasi adalah sinar-sinar kosmis dari luar angkasa, sinar radioaktif yang terdapat di alam, dan sinar ultraviolet. Mutasi juga bisa terjadi kerena suhu yang tinggi, adanya mutagen berupa senyawa-senyawa alkil yang
terdapat pada pestisida, defisiensi unsur hara ataupun karena bahan biologi seperti virus (Amato, 1977).
Materi genetik (DNA) tidak semuanya berada di dalam inti sel (nucleus). Hal tersebut terbukti dengan dijumpai bahwa beberapa sifat tanaman diturunkan dengan tidak menuruti pola hukum Mendel. Penyimpangan ini terjadi karena penurunan sifat juga dikontrol oleh gen-gen yang berada di luar inti sel atau sitoplasma, dan penurunan sifat model ini dikenal dengan istilah extranuclear inheritance. Kloroplas dan mitokondria merupakan organel diluar inti sel yang mengandung materi genetik (gen atau DNA) yang juga dapat termutasi (Bayu, 2005).
Mutasi pada gen kloroplas dapat menyebabkan terganggunya proses fotosintesis pada daun. Dampak mutasi gen kloroplas sering diekspresikan dengan munculnya perubahan warna pada daun tanaman. Mutasi di luar inti sel sering pula menimbulkan gejala pertumbuhan kerdil, berubahan morfologi bunga dan penyimpangan morfologi lainnya, dan ketahanan terhadap herbisida, yang biasanya disandikan oleh gen mitokondria (Bayu, 2005).
Seleksi alami pada awalnya bekerja pada level fenotipe, yang akhirnya mempengaruhi sifat-sifat yang diekspresikan. Organisme akan berusaha menyesuaikan diri dengan lingkungannya. Organisma ini akan lebih mampu bertahan hidup dalam jangka lama dan akan berkembang biak lebih banyak dan meneruskan gen-gennya lebih banyak pula ke generasi berikutnya (Elrod dan Stansfield, 2007).
Keragaman genetik tanaman sangat penting dalam hal pemuliaan tanaman dan keberlangsungan hidup tanaman. Tanaman dengan keragaman yang tinggi
akan memungkinkan untuk didapatkannya tanaman unggul melalui seleksi klon maupun melalui perbaikan genetik.
Menurut Hutami, dkk. (2006) keragaman genetik yang tinggi merupakan salah satu faktor penting untuk merakit varietas unggul baru. Peningkatan keragaman genetik dapat dilakukan dengan memanfaatkan plasma nutfah yang tersedia di alam dan dapat pula melalui persilangan. Usaha perbaikan genetik tanaman nilam memerlukan adanya plasma nutfah dengan keragaman genetik yang luas (Martono, 2009).
Informasi hubungan genetik antara individu di dalam dan di antara spesies mempunyai kegunaan penting bagi perbaikan tanaman. Dalam pemuliaan tanaman pendugaan hubungan genetik sangat berguna untuk mengelola plasma nutfah, identifikasi kultivar, membantu seleksi tetua persilangan serta mengurangi jumlah individu yang dibutuhkan untuk mengambil sampel dengan kisaran keragaman yang luas (Julisaniah dkk., 2008).
Nilam Aceh pada umumnya tidak berbunga sehingga peningkatan keragaman genetik tanaman nilam melalui hibridisasi seksual sulit dilakukan, Salah satu teknologi pilihan yang dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman adalah melalui teknologi kultur invitro. Regenerasi tanaman kultur sel (somaklonal) dapat berasal dari kalus (calliclones) atau dari protoplas (protoclones). Keragaman somaklonal disebabkan karena adanya sel-sel bermutasi maupun adanya polisomik dari jaringan tertentu. Keragaman tersebut dapat ditingkatkan dengan pemberian mutagen baik fisik maupun kimiawi (Hutami dkk. 2006). Menurut Martono (2009) keragaman hibrida somatik dapat merupakan hasil dari sub kultur kalus yang dilakukan terus menerus yang mengakibatkan suatu variasi somaklonal; ketidak stabilan dari kombinasi inti sel yang mengakibatkan hilangnya ekspresi gen atau hilangnya
bagian dari informasi genetik; dan adanya segregasi dari sitoplasma atau inti setelah fusi sehingga menghasilkan suatu kombinasi yang unik antara informasi genetik pada sitoplasma dan inti.