Data yang sudah didapatkan kemudian dianalisi secara statistik dengan uji One Way Anova dengan p= 0,05 dan dilanjutkan dengan Post Hoc Test
menggunakan program SPSS 17.0. One Way Anova adalah uji yang digunakan
untun menentukan perbedaan secara nyata pada mean keenam kelompok perlakuan. Sedangkan Post Hoc Test adalah analisis statistik data pada semua kelompok menggunakan Paired Sample T Test. Uji ini digunakan untuk mengetahui apakah ekstrak etanol 70% biji rambutan mampus menurunkan
46 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol 70% Biji Rambutan (Nephelium
lappaceum L ) Terhadap Kadar SOD Hepar Mencit yang di Induksi
Streptozotocin
Berdasarkan data rata-rata pengukuran kadar SOD pada hepar mencit DM 2 dengan pemberian ekstrak etanol 70% biji rambutan yang diinduksi streptozotocin didapatkan hasil yakni, uji normalitas menggunakan Kolmogorov-Smirnov diperoleh signifikansi >0,05 (0,167 > 0,05). Hal ini menunjukkan bahwa data terdistribusi secara normal. Kemudian dilakukan uji homogenitas (Levene), hasil uji homogenitas diperoleh signifikansi > 0,05 (0,129 > 0,05), hal ini menunjukkan bahwa data yang didapatkan telah homogen. Selanjutnya data diuji menggunakan uji ANOVA One-Way dengan taraf signifikan 5%.
Hasil ANOVA One-Way menunjukkan nilai signifikansi < 0,05 (0,00 < 0,05), sehingga hipotesa nol (H0) ditolak dan hipotesa 1 (H1) diterima. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol 70% biji rambutan secara signifikan dapat mempengaruhi kadar SOD pada hepar mecit DM 2 yang diinduksi streptozotocin, seperti yang ditunjukkan pada gambar 4.1.
Uji Duncan kemudian dilakukan untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan yang berpengaruh terhadap kadar SOD hepar. Hasil menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata (P > 0,05) antar perlakuan seperti yang terlihat pada tabel 4.1. Kontrol negatif (K-) berbeda nyata dengan P0 (tanpa ekstrak). P0 juga berbeda nyata dengan perlakuan P1 da P2.
47
Tabel 4.1. Hasil Uji Duncan Rata-Rata Kadar SOD Hepar Mencit
Kelompok perlakuan N Rata-rata SD
P0 (Dosis 0 Mg/kgBB) 4 10,331 ± 0,47a P3 (Dosis 23,4 Mg/kgBB) 4 11,831 ± 1,01a K+ (Kontrol Positif) 4 12,622 ± 2,69b K- (Kontrol Negatif) 4 15,983 ± 1,74b P1 (Dosis 15 Mg/kgBB) 4 18,400 ± 2,75c P2 (Dosis 19,2 Mg/kgBB) 4 20,678 ± 2,94c
Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan, P = nilai signifikansi
Gambar 4.1. Diagram nilai rata-rata perubahan kadar SOD pada hepar mencit DM 2 setelah pemberian terapi ekstrak etanol 70% biji rambutan yang diinduksi streptozotocin.
Dari hasil penelitian menunjukkan pada perlakuan P0 dengan dosis 0 mg/KgBB tanpa perlakuan terapi ekstra etanol 70% biji rambutan berbeda nyata dengan kontrol negatif yang menunjukkan terjadinya stres oksidatif pada perlakuan P0 tanpa terapi, hiperglikemia menjadi sebab terjadinya stres oksidatif ini. Sesuai dengan pernyataan Suastuti (2015) yang menyebutkan bahwa hiperglikemia dapat disebabkan oleh kelainan sekresi maupun gangguan kerja insulin. Hiperglikemia dalam diabetes dapat meningkatkan pembentukan radikal bebas dan menurunkan kadar antioksidan seperti SOD, keadaan ini akan berujung pada peristiwa stres oksidatif. Selanjutnya, Lach dan Michalak (2014) menyebutkan bahwa stres oksidatif dapat membahayakan mitokondria hepar karena dapat membentuk ekspresi gen yang tidak berpasangan. Peristiwa stres oksidatif di hepar ini dimulai dengan aktivasi CYP2E1. Aktivasi ini dapat menghasilkan ROS atau Reactive Oxygenated Species (terutama superoksida dan radikal hidroksil) yang dapat memicu stres oksidatif dan kematian sel.
Cossarizza et al., (2009) menjelaskan bahwa ROS adalah molekul yang selalu dibentuk sebagai hasil dari proses metabolisme pada umumnya. Turrens et
al., (1980) menambahkan bahwa dalam kondisi normal, kadar ROS dalam tubuh
diseimbangkan oleh kerja antioksidan enzimatik, salah satunya superoksida dismutase (SOD). Dharma (2012) menyebutkan bahwa SOD menyeimbangkan kadar ROS dengan cara mengkatalis radikal superoksida (O2-) yang terdismutasi menjadi hidrogen peroksida (H2O2). Selanjutnya, H2O2 dipecah oleh enzim
49
SOD adalah jenis enzim dalam cairan intraseluler yang ikut mendegradasi senyawa radikal bebas intraseluler (Wresdiyati, 2006). SOD menjadi antioksidan primer yang mampu mencegah pembentukan radikal bebas baru. Hal ini disebabkan karena SOD mampu merubah radikal bebas menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya sebelum sempat bereaksi (Winarsi, 2005). Aktivitas SOD sebagai antioksidan ini menjadi indikator pengukuran tingkat stres oksidatif dalam tubuh (Lisa, 2015).
Data dalam tabel 4.1 menunjukkan bahwa kadar SOD berbeda nyata pada dosis P1 (15 mg/kgBB) dan P2 (19,2 mg/KgBB) dibandingkan kontrol positif dan P0. Adanya perbedaan nyata ini membuktikan bahwa pemberian terapi ekstrak etanol 70% biji rambutan mampu meningkatkan kadar SOD hepar mencit yang diinduksi streptozotocin. Peningkatan kadar SOD ini disebabkan oleh kandungan zat bioaktif pada biji rambutan berupa senyawa metabolit sekunder fenol, tanin, dan flavonoid yang mampu menurunkan kadar glukosa (Fika, 2016; Yuda et al., 2015; Zulhipri et al., 2007).
Flavonoid adalah senyawa aktif jenis intermediet antioksidan yang berperan sebagai antioksidan hidrofilik dan lipofilik (Middleton et al., 2000). Yeum (2009) menyebutkan bahwa antioksidan hidrofilik dan lipofilik mampu secara sinergis melindungi sistem biologis dan mengurangi dampak dari aktivitas ROS. Antioksidan lipofilik seperti tokoferol dapat menangkap radikal oksigen yang mampu menghambat inisiasi dan propagasi reaksi rantai oksidatif dalam sistem hidrofilik. Flavonoid menangkap dapat ROS secara langsung, mencegah regenerasi ROS, dan secara tidak langsung mampu meningkatkan aktivitas enzim
antioksidan seluler. Pencegahan terbentuknya ROS oleh flavonoid terjadi dengan mekanisme penghambatan kerja enzim Xantin oksidase dan nicotinamide Adenine
Dinucleotide Phospahe (NADPH) oxidase serta mengkelat logam (Fe2+ dan Cu2+). Dengan mekanisme ini, reaksi redoks yang dapat membentuk radikal bebas dapat dicegah (Akhlaghy dan Bandy, 2009). Lebih jelas Sugito (2012) memaparkan bahwa kenaikan kadar SOD dalam hepar diakibatkan komponen fenolik yang menginduksi secara berturut-turut enzim antioksidan, antioxidant receptor
element (ARE) dan DNA untuk menghasilkan enzim antioksidan. Komponen
fenolik suatu tanaman diduga dapat memicu ekspresi gen enzim antioksidan seperti Mn-SOD dan Cu/Zn-SOD hepar sehingga aktivitasnya meningkat. Wu et
al (2004) menambahkan bahwa komponen fenolik merupakan antioksidan
hidrofilik yang secara mudah mampu mendonorkan satu atom hidrogen pada ROO*.
Jawi (2012) menyebutkan bahwa mekanisme flavonoid secara tidak langsung adalah dengan aktivasi Nuclear factor erythroid 2 related factor 2 (Nrf2) yang menjadikan kenaikan gen yang berperan dalam sintesis enzim antioksidan seperti gen SOD Niture et al (2009) menambahkan terkait mekanisme peningkatan kadar SOD melalui perbaikan stres oksidatif terjadi dengan mekanisme penghambatan Nuclear Respiratory Factor 2 (Nrf2) sistein 151 dan fosforilasi yang dimediasi PKC dan Serine 40 Nrf2 untuk mengeluarkan Nrf2 dari
Inhibitory Nuclear Respiratory Factor 2 (INrf2). Aktivasi dari Nrf2 kemudian
ditranslokasi pada nukleus, berikatan pada Antioxidant Respond Element (ARE) dan meregulasi kembali ekspresi gen enzimatik seperti SOD yang mampu
51
melindungi dan memperbaiki kerusakan sel akibat stres oksidatif. Kinerja flavonoid dalam meningkatkan antioksidan endogen ini telah dibuktikan dalam penelitian in vitro melalui peningkatan faktor transkripsi Nrf2 yang meningkatkan ekspresi protein HO1. Peningkatan faktor transkripsi Nrf2 ini sebelumnya diawali dengan aktivasi ERK, JNK dan P38 (Maher dan Hanneken, 2005 ; Huang et al., 2013).
Gambar 4.2 Aktivasi Nrf2 (Respon terhadap ROS, Nrf2 bertranslokasi ke nukleus dan berikatan pada ARE) (Joshi G dan Johson JA, 2012)
Nrf2 sendiri merupakan kofaktor transkripsi sitoprotektif penting. Nrf2 akan diaktifkan ketika stres retikulum endoplasma maupun dengan adanya oksidan dan elektrofil. Nrf2 terdiri dari 6 domain yaitu Neh1 yang merupakan domain dengan struktur bZIP yang dibutuhkan untuk berikatan dengan DNAdan membentuk dimer. Neh2, yakni sisi yang berinteraksi dengan keap1. Neh3,4,5 memperantai aktivitas transaktivasi Nrf2 dengan berikatan pada CREB binding protein (CBP) dan domain Neh6 yang berperan dalam regulasi negatif (Kobayashi M dan Yamamoto M, 2005).
Biji rambutan selain mengandung flavonoid juga mengandung fenol dengan kadar yang cukup tinggi. Komposisi senyawa kimia dalam biji rambutan dapat menurunkan kadar gula dalam darah sehingga biji rambutan banyak
dimanfaatkan sebagai obat alternatif untuk menormalkan kadar gula darah penderita diabetes melitus yang cenderung tinggi (Khasanah, 2011).
4.2 Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol 70% Biji Rambutan (Nephelium
lappaceum L ) Terhadap Kadar MDA Hepar Mencit yang di Induksi
Streptozotocin
Berdasarkan data rata-rata pengukuran kadar MDA pada hepar mencit DM 2 dengan pemberian ekstrak etanol 70% biji rambutan yang diinduksi streptozotocin setelah diuji menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov didapatkan hasil nilai signifikansi < 0,05 (0,00 < 0,05). Hal ini menunjukkan bahwa data tidak terdistribusi secara normal, kemudian dilakukan transformasi data dan didapatkan hasil signifikansi yakni < 0,05 (0,00 < 0,05), data tetap tidak terdistribusi secara normal. Sehingga dilakukan uji alternatif lain yakni uji non parametrik Kruskall-Wallis (Petri dan Sabin, 2000). Uji ini digunakan untuk membandingkan dua variabel atau lebih yang tidak berpasangan (Dahlan, 2009). Perhitungan uji Kruskall-Wallis seperti yang tersaji pada lampiran 5 menunjukkan nilai signifikansi sebesar 0,001 < 0,05, sehingga menunjukkan hasil bahwa hipotesa nol (H0) ditolak dan hipotesa satu (H1) diterima. Hal ini menunjukan bahwa pemberian ekstrak etanol 70% biji rambutan secara signifikan dapat mempengaruhi kadar MDA pada hepar mencit DM 2, seperti yang tersaji pada gambar 4.2.
Hasil hipotesa nol (H0) ditolak dan hipotesa satu (H1) diterima menjadikan perlu adanya uji lanjutan yakni Post Hoc Multiple Comparisons dengan metode Mann-Whitney untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan yang
53
berpengaruh terhadap kadar MDA hepar mencit. Sesuai dengan yang tersaji pada tabel 4.2, terjadi perbedaan yang nyata antar perlakuan (perlakuan < 0,05).
Tabel 4.2 : Rata-rata Kadar MDA Hepar Mencit
Perlakuan N Rata-rata ± SD (mg/ml) P2 4 0,105 ± 0,013 P1 4 0,110 ± 0,011 K- 4 0,150 ± 0,014 P3 4 0,411 ± 0,024 K+ 4 0,416 ± 0,016 P0 4 1,549 ± 0,363
Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan, P= nilai signifikansi (0,05)
Gambar 4.3 : Diagram nilai rata-rata perubahan kadar MDA pada hepar mencit DM 2 setelah pemberian terapi ekstrak etanol 70% biji rambutan yang diinduksi streptozotocin.
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, kadar MDA tertinggi ditunjukkan pada perlakuan P0 (tanpa ekstrak). Kadar MDA P0 yang lebih tinggi dibandingkan dengan K- (Kontrol negatif) ini menunjukkan bahwa mencit yang diberi perlakuan P0 mengalami stres oksidatif akibat peningkatan radikal bebas. Diabetes melitus menyebabkan peningkatan sintesis lemak dalam hati (Guyton, 1997). Akumulasi asam lemak dalam hati ini kemudian dapat memicu pembentukan radikal bebas (Tolman dkk, 2007). Stres oksidatif merupakan suatu keadaan patologis akibat kerusakan jaringan tubuh karena peningkatan jumlah radikal bebas yang tidak normal (Yustika, et al., 2013).
Senyawa radikal bebas terutama hidoksil (OH-) menyebabkan peroksidasi lipid dan menghasilkan produk senyawa malonaldehid (MDA) (Muller, 2006). MDA adalah senyawa sitotoksik yang terbentuk dari akhir tahapan proses peroksidasi lipid. Dengan sifat sitotoksik ini, MDA menjadi senyawa petunjuk terjadinya stres oksidatif karena mampu menggambarkan aktivitas radikal bebas di dalam sel (Asni et al., 2009; Huang et al., 2011).
Mekanisme pembentukan MDA melalui peroksidasi lipid dimulai dengan hilangnya atom hidrogen (H) dari molekul lipid tak jenuh rantai panjang oleh gugus radikal hidroksil (OH-), menyebabkan lipid bersifat radikal. Selanjutnya, radikal lipid bereaksi dengan atom oksigen (O2) membentuk radikal peroksil (OO) yang pada akhirnya menghasilkan MDA (dengan ikatan tak jenuh lebih dari tiga) (Yustika, 2013). Yunus (2001) menambahkan bahwa MDA dapat terbentuk
55
apabila radikal bebas hidroksil seperti ROS bereaksi dengan komponen asam lemak dari membran sel sehingga terjadi reaksi peroksidasi lemak. Peroksidasi lemak tersebut memutus rantai asam lemak menjadi berbagai senyawa toksik yang merusak membran sel.
Berdasarkan tabel 4.2, kadar MDA pada P1 dan P2 lebih kecil dibandingkan dengan P0 dan K+. Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% biji rambutan dapat menurunkan kadar MDA pada hepar mencit. Sama halnya dengan meningkatnya kadar SOD pada pembahasan sebelumnya, penurunan kadar MDA ini juga disebabkan oleh kandungan flavonoid dalam biji rambutan yang berfungsi mentransfer atom H+ (Middleton et al., 2000). Flavonoid merupakan pendonor hidrogen pada radikal bebas, menyebabkan kestabilan radikal berenergi rendah (Castelluccio et al., 1996).
Ekstrak etanol 70% biji rambutan mampu mencegah peroksidasi lipid pada tahap inisiasi dan propagasi. Pada tahap inisiasi, peroksidasi lipid dapat dicegah oleh peredam radikal bebas. Sementara pada tahap propagasi diputus oleh
peredam radikal peroksil seperti antioksidan flavonoid (LOO + FL-OH, LOOH + FL-O , FL-OH adalah flavonoid) (Middleton et al., 2000). Mekanisme
lain dalam menurunkan kadar MDA juga bisa dilakukan dengan cara meningkatkan antioksidan endogen yakni SOD, seperti yang telah dipaparkan sebelumnya pada pembahasan 4.1.
Hasil penelitian Nugraheni et al. (2011) menunjukkan bahwa triterpenoid dapat menghambat peroksidasi lipid pada tahap inisiasi dengan menghambat radikal peroksil serta di tahap akhir dengan menghambat produk sekunder,
misalnya malondialdehid. Bastona dan Leroux (2007); Ghosh et al. (2010) melaporkan triterpenoid dapat menghambat aktivitas enzim sitokrom P450 sehingga proses peroksidasi lipid akibat radikal bebas dapat dicegah.
Allah berfiman dalam surat al-Qamar (54) ayat 49 yang berbunyi :
ٍرَدَقِب ُهََٰنْقَلَخ ٍءْىَش َّلُك َّنَِّإ
Artinya : Sesungguhnya Kami menciptakan segala sesuatu menurut ukuran. Lafadz (ِ رَدَقِبِ ُه ََٰنْقَلَخ) menjelaskan bahwa Allah menciptakan segala sesuatu dengan ukurannya masing-masing, semua tidak tercipta dengan ukuan yang sama (Shihab, 2002). Dalam hal ini kaitannya dengan dosis efektif atau dosis yang sesuai ukuran dalam menaikkan kadar SOD dan MDA pada hepar mencit menggunakan ekstrak etanol 70% biji rambutan adalah dosis 15 Mg/kgBB (P1) dan dosis 19,2 Mg/kgBB (P2). Kata (رَدَقِب) dari segi bahasa berarti kadar tertentu yang telah ditetapkan terhadap segala sesuatu dengan suatu sistem (Shihab, 2002). Dalam hal ini, kata tersebut dapat bermakna dosis tertentu yang telah ditetapkan atau yang sesuai dalam pengaturan kadar SOD dan MDA sel hepar dalam mengatur kondisi stres oksidatif.
Semua penyakit datang dari sang Maha Kuasa Allah SWT, begitu pula obatnya, namun untuk memperoleh kesembuhan diperlukan usaha dan do’a (Al-Jauziyah, 2008). Penelitian ini menjadi usaha tersendiri untuk menangani peristiwa stres oksidatif yang dialami penderita diabetes melitus tipe 2 dalam mencari dosis yang paling efektif untuk menaikkan kadar SOD dan menurunkan kadar MDA menggunakan ekstrak etanol 70% biji rambutan.
57
Allah berfirman dalam surah Al-An’am (6) ayat 95 :
َن وُكَفُْْ ت ََّٰنىَأَف ُه َٰ للا ُمُكِلَٰٰ ِىَْلحا َن ِم ِت ِيَمْلا ُجِرُْمُ َو ِت ِيَمْلا َنِم َّىَْلحا ُجِرُْيَ َٰىَوَّ نلاَو ِبَْلحا ُقِلاَف َه َٰ للا َّنِإ
Artinya : Sesungguhnya Allah menumbuhkan butir tumbuh-tumbuhan dan bijibuah-buahan. Dia mengeluarkan yang hidup dari yang mati dan mengeluarkan yang mati dari yang hidup. (Yang memiliki sifat-sifat) demikian ialah Allah, maka mengapa kamu masih berpaling?
Kata (ىَوَّنلا َو) bermakna biji-bijian, ayat ini menunjukkan bukti kekuasaan Allah yakni tentang penciptaan biji. Allah menumbuhkan buah-buahan dari biji-bijian. Buah-buahan bisa memiliki manfaat bagi manusia, begitu pula dengan bijinya (Shihab, 2002). Contohnya seperti pada penelitian ini yakni dengan menggunakan biji rambutan yang diekstrak kemudian digunakan sebagai obat herbal untuk penyakit diabetes tipe 2 dengan cara menaikkan kadar SOD dan menurunkan kadar MDA. Biji rambutan sendiri mengandung senyawa flavonoid yang diduga sebagai agent antidiabetes (Thitilertdecha, 2008).