Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Biokimia Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-BIOGEN) sejak Maret 2009 hingga April 2011. Tanaman Sumber Virus
Koleksi dan Pengumpulan Tanaman Sakit. Koleksi dan pengumpulan tanaman sakit dilakukan di sentra produksi tomat di Cikajang-Garut (pada ketinggian 1287 m dpl), Cipanas-Cianjur (1225 m dpl). Pengamatan ditujukan terhadap tanaman tomat yang bergejala klorosis, yaitu klorosis diantara tulang daun, daun berwarna keunguan dan nekrotik, serta mudah rapuh. Tanaman tomat yang menunjukkan gejala tersebut kemudian diambil bagian pucuk daun yang berkembang penuh, dan ditempatkan di dalam coolbox agar daun tersebut tetap segar sampai di laboratorium sebelum diberi perlakuan lebih lanjut. Keberadaan TICV pada sampel daun yang diambil dipastikan melalui metode RT-PCR.
Deteksi TICV dan ToCV dengan RT-PCR. Sebanyak 0.1 g jaringan daun tomat didinginkan dengan nitrogen cair, kemudian dilumatkan dengan mortar sampai menjadi tepung halus dan RNA total diekstraksi menggunakan RNeasy Plant Mini Kits (Qiagen). RNA hasil ekstraksi disintesis menjadi cDNA dengan menggunakan teknik RT. Reaksi RT dibuat dengan total volume 10 µl yang mengandung 2 µl RNA total, 1 µl buffer RT 10X, 0,35 µl 50 mM DTT (dithiothreitol), 2 µl 10 mM dNTP (deoksiribonukleotida triphosphat), 0,35 µl M- MuLV Rev, 0,35 µl RNase inhibitor, 0,75 µl oligo (dT), dan 3,2 µl H2O. Reaksi
RT dilakukan dalam sebuah Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA) yang diprogram untuk satu siklus pada suhu 25ºC selama 5 menit, 42ºC selama 60 menit, dan 70ºC selama 15 menit. Siapan cDNA hasil RT digunakan sebagai template dalam reaksi PCR. Reaktan PCR dengan total volume 25 µl terdiri atas 1 µl masing-masing primer spesifik ToCV (ToCV-CP R-Hind: 5’-
16
AATTAAAAGCTTTTAGCAACCAGTTATCGATGCAAG-3’ dan ToCV-CP F- Bam no ATG: 5’-AATTAAGGATCCGAGAACGATGCTGTTAC-3’) dan spesifik TICV (TICV–CP F-Bam no ATG ( 5’- AATTAAGGATCCGAAAACTTATCTGGTAATGCAAAC-3’ dan TICV–CP R-Hind 5’-AATTAAAAGCTTTTAGCATGGGTGTTTCATATCAGCC-3’), 2,5 µl buffer PCR 10X + Mg2+, 0,5 µl 10 mM dNTP, 2,5 µl sucrose cresol 10X, 0,3 µl
Taq DNA polymerase, 14,2 µl H2O, dan 1 µl DNA template. PCR dilakukan pada Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA). Proses ini didahului dengan denaturasi awal pada 94ºC selama 4 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 55ºC selama 1 menit, dan pemanjangan (Extension) pada 72ºC selama 2 menit, dan diikuti pemanjangan akhir pada 72ºC selama 10 menit. Amplikon hasil PCR dielektroforesis dengan 1% agarose gel yang mengandung ethidium bromida (EtBr) dan TAE bufer dengan voltase 50V selama 60 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan
Transluminator UV dan didokumentasikan dengan kamera digital. Karakterisasi Gen CP TICV
Ekstraksi RNA Total. Ekstraksi RNA total dilakukan dengan menggunakan RNeasy Plant Mini Kits (Qiagen) dan dikerjakan sesuai dengan protokol yang diberikan (Qiagen 2003). Sebanyak 0.1 g daun tomat yang didinginkan dengan nitrogen cair dilumatkan sampai menjadi tepung halus dengan menggunakan mortar steril. Hasil gerusan dimasukkan dalam tabung mikro 2 ml dan ditambahkan buffer ekstraksi (RLT) yang mengandung 1% merkaptoetanol. Setelah divortek 1 menit, sampel diinkubasi pada suhu 56 °C selama 10 menit, kemudian dimasukkan ke dalam QIA shredder spin column yang ditempatkan pada tabung koleksi 2 ml dan disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit. Selanjutnya supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml dan ditambah dengan 0.5 volume etanol 96% (± 225 µl), lalu dimasukan ke dalam RNeasy mini column pink di dalam tabung koleksi 2 ml. Setelah disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 detik, mini column dicuci dua kali dengan 700 µl buffer RW1 dan 500 µl bufer RPE serta disentrifugasi dengan kecepatan yang sama selama 2 minit. Cairan yang ada dalam tabung koleksi
dibuang dan mini column diletakan balik dalam tabung koleksi untuk dikeringkan dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 2 menit. RNA total yang terikat dalam mini column dielusi dengan 40 µl RNAse free water ke dalam Rneasy dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 1 menit dalam tabung mikro yang baru setelah didiamkan selama 10 menit.
Sintesis complementary (c) DNA. RNA hasil ekstraksi disintesis menjadi cDNA dengan menggunakan teknik Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Reaktan RT-PCR dibuat dengan total volume 10 µl yang mengandung 2 µl RNA total, 1 µl buffer RT 10X, 0,35 µl 50 mM DTT (dithiothreitol), 2 µl 10 mM dNTP (deoksiribonukleotida triphosphat), 0,35 µl M- MuLV Rev, 0,35 µl RNase inhibitor, 0,75 µl oligo (dT), dan 3,2 µl H2O.
Komponen-komponen tersebut digunakan untuk satu kali reaksi RT. Reaksi RT dilakukan dalam sebuah Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA) yang diprogram untuk satu siklus pada suhu 25ºC selama 5 menit, 42ºC selama 60 menit, dan 70ºC selama 15 menit. Siapan cDNA hasil RT digunakan sebagai template dalam reaksi PCR.
Amplifikasi Gen CP-TICV dengan PCR. Reaktan PCR dengan total volume 25 µl terdiri atas 1 µl masing-masing primer, 2,5 µl buffer PCR 10X + Mg2+, 0,5 µl 10 mM dNTP, 2,5 µl sucrose cresol 10X, 0,3 µl Taq DNA polymerase, 14,2 µl H2O, dan 1 µl cDNA. PCR dilakukan pada Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA). Proses ini didahului dengan denaturasi awal pada 94ºC selama 4 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 55ºC selama 1 menit, dan pemanjangan (Extension) pada 72ºC selama 2 menit. Khusus untuk siklus terakhir ditambahkan 10 menit pada 72ºC untuk sintesis poliadenalin (poli A) yang diperlukan kloning ke dalam T-A cloning vector (pGEMT-Easy (Promega)), dan siklus berakhir pada suhu 4ºC. Produk PCR dielektroforesis dalam 1% agarose gel yang mengandung ethidium bromida dan TAE bufer dengan voltase 50V selama 60 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan Transluminator UV dan didokumentasikan dengan kamera digital.
18
Perunutan Nukleotida dan Asam Amino Gen CP-TICV. Sebanyak 50µl PCR sampel yang positif mengandung CP-TICV dikirim ke PT. Macrogen Incorporation (Korea Selatan). Hasil perunutan nukleotida dan asam amino kemudian digunakan untuk analisis kesejajaran dengan runutan nukleotida dan asam amino TICV yang telah dipublikasikan di GenBank dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) (NCBI 2010). Analisis filogenetika dilakukan menggunakan program PHYLIP versi 3.6 (University of Washington). Sebelum dianalisis, runutan nukleotida semua isolat yang terpilih dimodifikasi dengan software Clustal X 1.83 untuk menyamakan format runutannya. Matrik jarak genetika dihitung dengan menggunakan matrik parameter dalam program komputer DNA ML dan untuk runutan asam amino CP menggunakan ProML. Pohon filogenetika digambarkan dengan program DRAWTREE dalam paket program PHYLIP. Analisis boostrap dengan 1000 ulangan dilakukan menggunakan program SEQBOOT dan konsensus pohon filogenetika dibuat dengan program CONSENSE. Pohon filogenetik digambarkan dengan program Mega 4 dalam paket program PHYLIP.
Ekspresi Gen CP-TICV pada E. coli strain BL21(DE3)pLysS
Kloning CP-TICV. Kloning gen CP-TICV telah dilakukan di Jepang (kerjasama dengan Utsunomiya University). Hasilnya plasmid pGEM-CP yang ditransformasi ke dalam E.coli strain DH5α.
Konstruksi Vektor Ekspresi. Ekpresi gen CP-TICV dalam pET-21b(+) dilakukan dengan menggunakan promoter T7. Gen CP-TICV disisipkan pada tempat pemotongan BamHI/HindIII yang terletak antara promoter T7 pada ujung depan setelah start kodon dan 6xhis-tag pada ujung belakang sebelum stop kodon dari pET-21b(+) sehingga terbentuk pET21-CP.
Persiapan Kompeten Sel E. coli strain BL21(DE3)pLysS. Stok E. coli
strain BL21(DE3)pLysS dalam gliserol digores pada media LB agar yang mengandung antibiotik Ampisilin 50 µg/ml dan Kloramfenikol 20 µg/ml, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C semalam. Satu kultur biakan E. coli
kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C semalam. Sekitar 2 ml kultur semalam tersebutdiambil dan dipindahkan ke dalam 40 ml media A (LB, MgSO47H2O 10
mM, gukosa 0.2%), lalu diinkubasi selama 2 jam. Setelah 2 jam kultur bakteri dipindahkan ke tabung Falcon steril dan diinkubasi dalam es selama 10 menit. Sentrifugasi biakan yang berada pada tabung Falcon dengan kecepatan 4000 rpm, selama 15 menit pada suhu 4 °C. Supernatan dibuang dan diambil peletnya. Pelet diresuspensi dengan 2.5 ml media B (LB, glyserol 36%, PEG 7000 12%, dan MgSO47H2O 12 mM). Siapan bakteri tersebut kemudian dipindahpisahkan
masing-masing 100 µl ke tabung eppendorf 1.5 ml dan disimpan di freezer -80 °C sampai digunakan untuk transformasi (Nishimura et al. 2003).
Transformasi. Sebelum dilakukan transformasi terlebih dahulu dilakukan ligasi antara fragmen CP-TICV dengan vektor ekspresi pET-21b(+) (Novagen, Germany) yang masing-masing telah dipotong dengan enzim restriksi BamH1 dan HindIII. Ligasi dilakukan dalam volume 10 µl yang terdiri dari plasmid pET- 21b 2 µl, CP-TICV 2 µl, buffer T4 DNA ligase 2x sebanyak 5 µl, dan T4 DNA ligase 1 µl (3 U/µl). Kemudian diinkubasi pada suhu 4oC selama 16 jam. Transformasi dilakukan dengan mencampur 10 µl hasil ligasi dengan 100 µl sel kompeten BL21(DE3)pLySs. Terhadap siapan ini berturut-turut dilakukan diinkubasi dalam es batu selama 20 menit, heat shock pada suhu 42 °C selama 1 menit, didinginkan dalam es batu selama 2 menit, ditambahkan 500 µl LB cair, dan diinkubasi dengan dishaker pada suhu 37 °C selama 4 jam, kemudian disentrifuse 12000 rpm 1 menit, supernatan dibuang, pelet dan LB yang masih tersisa sampai 100 µl dihomogenasi, dan terakhir ditumbuhkan dalam media LB agar yang telah diberi ampisilin 50 µg/ml dan kloramfenikol 20 µg/ml.
(Sambrook & Russel 2001).
Konfirmasi Transforman. Untuk mengonfirmasi transforman yang membawa plasmid pET21-CP maka transforman ditumbuhkan pada media LB cair yang mengandung 50 μg/ml ampisilin dan 20 μg/ml kloramfenikol. Sel dari biakan yang berumur 18 jam dipanen dan diisolasi palsmidnya dengan metode alkalin lisis (Sambrook & Russel 2001). Plasmid pET21-CP dipotong dengan enzim restriksi BamHI dan HindIII. Selain dicek dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi, klon rekombinan dicek dengan PCR.
20
Isolasi Plasmid dengan Metode Alkalin Lisis. Satu koloni bakteri diinokulasi ke dalam 10 ml LB dan diinkubasi semalam pada suhu 37 °C, kemudian dipindahkan ke tabung eppendorf 1.5 ml dan disentrifugasi 12.000 rpm pada 4 °C selama 2 menit. Setelah itu supernatan dibuang. Resuspensi pelet dengan 100 µl larutan I (50 mM glukosa, 10 mM EDTA, 25 mM Tris pH 8.0, 2 mg/ml lisozyme (ditambahkan saat akan digunakan)), kemudian divortex, ditambahkan 200 µl larutan II (0.2 M NaOH, 1% SDS dibuat saat akan digunakan), divortex, ditambahkan 150 µl larutan III (3 M NaOAc pH 4.8), tabungnya dibolak-balik agar bercampur, disentrifuse 12.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru, ditambahkan 300 µl phenol kloroform, vortex, sentrifuse 12.000 rpm 5 menit. Larutan yang paling atas dipindahkan ke tabung yang baru, kemudian ditambahkan etanol absolut 2 x volume, sentrifuse 12.000 rpm selama 20 menit, supernatan dibuang, dicuci dengan 800 µl etanol 70%, vortex, disentrifuse 12.000 rpm 5 menit, supernatan dibuang, pelet dikering-anginkan, kemudian diresuspensi dengan 30 µl buffer TE atau ddH2 O (Sambrook & Russel 2001).
Koloni PCR. Satu klon transforman diambil dengan tusuk gigi, kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang telah diisi dengan ddH2O 10 µl,
kemudian diinkubasi pada suhu 95 °C selama 10 menit, setelah itu dimasukkan ke dalam komponen PCR. Koloni tersebut digunakan sebagai templatenya. Reaktan PCR dilakukan dengan volume total 12.5 µl, terdiri dari 2.5 µl buffer PCR (500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl, pH 9; 1% Triton X-100), dan 0.3 µl taq DNA polymerase, H2O 7.2 µl, dNTP 10 mM 0.5 µl, primer forward TICV – CP
AATTAAGGATCCGAAAACTTATCTGGTAATGCAAAC dan primer reverse TICV – CP AATTAAAAGCTTTTAGCATGGGTGTTTCATATCAGCC masing-masing 1 µl. Reaksi PCR dilakukan dengan Perkin Elmer 480 Thermocycler dan dikondisikan untuk denaturasi inisiasi pada 94 °C selama 4 menit, kemudian dilanjutkan 30 siklus yang terdiri dari denaturasi 94 °C selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 55 °C selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72 °C selama 2 menit, dan diikuti pemanjangan akhir pada suhu 72 °C selama 10 menit. Hasil koloni PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% dalam TAE buffer yang mengandung EtBr dengan voltase 90 V
selama 30 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan Transluminator UV
dan didokumentasikan dengan kamera digital.
Pemotongan pET-21CP dengan Enzim Restriksi. Plasmid pET 21-b(+) dipisahkan dengan insertnya (CP-TICV) dengan menggunakan enzim restriksi
BamHI dan HindIII dengan komposisi 1 µl plasmid pET 21-CP, 1 µl enzim restriksi BamHI dan HindIII, 1 µl buffer 2, dan dd H2O 7 µl. Larutan tersebut
diinkubasi 37 °C selama 3 jam. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi dielektroforesis pada gel agarose 1% dalam TAE buffer yang mengandung EtBr dengan voltase 90 V selama 30 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan Transluminator UV dan didokumentasikan dengan kamera digital.
Purifikasi Protein CP-TICV
Kultur Ekspresi. E.coli strain BL21 (DE3)pLysS yang membawa plasmid rekombinan pET21-CP diinokulasi ke dalam 3 ml media LB yang mengandung 50 μg/ml ampisilin dan 20 μg/ml kloramfenikol. Biakan diinkubasi di dalam
orbital shaker (75 rpm) pada suhu 37 oC semalam. Kemudian sebanyak 100 μl biakan di inokulasikan ke dalam 10 ml media LB yang mengandung antibiotik dan diinkubasikan di dalam orbital shaker (75 rpm) pada suhu 37 oC. Setelah pertumbuhan bakteri mencapai OD600 0.5 (kira-kira 5-6 jam), biakan diinduksi
dengan 1 mM IPTG dan diinkubasikan semalam. Sel bakteri yang mengekpresikan protein rekombinan dipanen dengan sentrifugasi (12.000 rpm, 4oC, 15 menit) dan dilisis dengan buffer B-7M Urea 300 µl dan turbonuclease 3 Unit/ml kultur (0.4 µl) (Nacalai, Japan). Sel hasil lisis disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit. Protein rekombinan yang ada dalam supernatan (soluble protein) dan pelet (insoluble protein) dianalisis dengan analisis SDS-PAGE.
Purifikasi dengan NiNTA Spin Column pada Kondisi Denaturasi. Sel dicairkan selama 15 menit dan diresusupensi dengan 300 µl buffer B-7M urea dan ditambahkan dengan 0.4 µl turbonuclease (Nacalai, Japan), kemudian sel diinkubasi dengan agitasi selama 15 menit pada suhu 20oC. Lysate disentrifugasi pada 12000 rpm selama 30 menit pada suhu ruang, supernatan diambil. Ekuilibrasi NI-NTA (Nickel nitrilotriacetic acid) spin column (Qiagen) dengan 600 µl buffer B-7M urea, disentrifugasi dengan kecepatan 2900 rpm selama 2
22
menit. 600 µl supernatan jernih yang mengandung protein 6xHis-tagged diambil dan dimasukkan pada Ni-NTA spin column (Qiagen). Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1600 rpm selama 5 menit dan diambil bawahnya, dimasukkan ke tabung mikro untuk dianalisis SDS-PAGE. Kemudian Ni-NTA spin column dicuci dengan 600 µl buffer C, disentrifugasi 2900 rpm selama 2 menit, dilakukan sebanyak dua kali. Kemudian protein dimurnikan (elusi) dua kali dengan menambahkan 200 µl buffer E, disentrifugasi 2900 rpm selama 2 menit dan hasil elusi disimpan pada -20 oC sampai digunakan untuk analisis SDS-PAGE.
Analisis SDS-PAGE. Setelah diperoleh protein murni, dilakukan analisis SDS-PAGE (Laemmli 1970). Sebanyak 10.000 µl separating gel 12,5% 0.375 M tris pH 8.8 dibuat dengan mencampur akuades 3355 µl, tris HCl 1.5 M pH 8.8 2500 µl, SDS 10% 100 µl, acrylamide/bis 4000 µl, amonium persulfat (APS) 10% 35 µl, dan temed (Merck) 10 µl, kemudian dipipet pada cetakan gel. Setelah separating gel membeku maka stacking gel 4% 0.125 M tris pH 6.8 dibuat dengan mencampur akuades 3027.5 µl, tris HCl 0.5 M pH 6.8 1250 µl, SDS 10% 50 µl, acrylamide/bis 650 µl, APS 10% 17.5 µl, dan temed (Merck) 5 µl, kemudian dipipet dan diletakkan diatas separating gel yang sudah membeku dan stacking gel ditunggu sampai membeku. Setelah stacking gel membeku, dipindahkan ke dalam alat elektroforesis. Sebanyak 10 µl marker protein (Fermentas) dan 60 µl (30 µl hasil purifikasi + 30 µl loading buffer (Sigma)) didenaturasi pada suhu 95
o
C selama 10 menit. Sekitar 10 µl marker dipipet dan dimasukkan ke dalam gel yang diletakkan pada alat elektroforesis, sedangkan untuk hasil purifikasi yang telah dicampur dengan loading buffer diambil 15 µl dan dimasukkan ke dalam gel yang diletakkan pada alat elektroforesis.
Elektroforesis dilakukan dengan Biorad power pac 300 selama 2 jam dengan voltase 150 V. Kemudian gel hasil elektroforesis dilepas dari cetakannya dan dimasukkan ke dalam larutan staining (coomassie brilliant blue R-250, metanol, asam asetat glasial) dan dishaker semalaman, setelah itu dicuci dengan larutan distaining (metanol, asam asetat glasial, aquades) sampai gel terlihat bening dan pita protein terlihat berwarna biru, hasilnya kemudian difoto.