Telur 24 18 2,38 2.18 0,75 0.75
Nauplii 31 14 3,04 1.33 0,88 0.5
Zoea 11 8 1,07 1.19 0,44 0.57
Mysis 40 18 3,42 2.55 0,93 0.88
Post larva 21 18 2,45 2.58 0,80 0.89
Antara hasil T-RFLP dan ARDRA, hasil yang didapatkan konsisten, yaitu bahwa komunitas bakteri yang berasosiasi dengan larva udang putih berubah secara dinamis selama tahapan perkembangan. Masing-masing tahapan perkembangan memiliki komunitas bakteri yang unik. Jenis filotipe maupun jumlah relatifnya berubah mengikuti perkembangan larva, tetapi ada juga filotipe yang selalu ada dalam semua tahapan perkembangan. Untuk ARDRA, hanya sedikit tipe sama yang ditemukan pada komunitas yang berbeda. Hal ini diduga juga diakibatkan cakupan pustaka genom yang masih kurang menggambarkan keseluruhan komunitas.
Untuk jenis bakteri yang dominan pada masing-masing komunitas bakteri, teknik T- RFLP kurang dapat mengidentifikasi dengan tepat. Dengan 2 enzim restriksi yang digunakan, masih cukup banyak kemungkinan jenis-jenis yang diwakili oleh masing- masing TRF. Karena itu identifikasi hanya dilakukan sebatas filum saja. Perbedaan yang didapatkan antara T-RFLP dan ARDRA adalah kelompok yang dominan di hampir seluruh tahapan adalah α-dan -Proteobacteria dengan ARDRA, sementara dengan T- RFLP adalah -dan α-Proteobacteria (Tabel 12.). Selain karena bias yang disebabkan prosedur PCR, perbedaan ini juga dapat terjadi karena kemungkinan jenis-jenis bakteri yang berasosiasi dengan larva udang putih ini adalah jenis baru dan belum ada dalam database.
Tabel 12. Perbandingan kelompok yang dominan pada tahap-tahap perkembangan larva dengan menggunakan teknik berbeda
Kultur T-RFLP ARDRA
Nauplii -Proteobacteria Bacteroidetes -Proteobacteria Zoea -Proteobacteria Cyanobacteria Chloroflexi Mysis -Proteobacteria -Proteobacteria - dan α-Proteobacteria PL Firmicutes -Proteobacteria -Proteobacteria
Pengaruh Perlakuan Iodine Terhadap Komunitas Bakteri
Sejauh ini, penelitian ini merupakan yang pertama mempelajari dinamika populasi komunitas bakteri yang berasosiasi selama tahapan perkembangan larva udang yang dilakukan dengan teknik berbasis molekuler. Walaupun memiliki keterbatasan dalam identifikasi filotipe secara tepat, T-RFLP terbukti merupakan alat yang berguna untuk monitoring dinamika populasi pada komunitas bakteri yang kompleks. Teknik ini dapat mendeteksi perubahan pada komunitas bakteri akibat perlakuan spesifik seperti intoduksi suplemen pakan maupun probiotik untuk meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup L. vannamei. T-RFLP telah digunakan untuk memonitor efek suplementasi
Lactobacillus acidophilus NCFM pada tikus (Kaplan et al. 2001) atau memonitor perubahan pada mikrobiota manusia setelah pemberian antibiotik dan probiotik (Jernberg et al. 2005). Studi yang mirip dapat dilakukan juga pada L. vannamei dengan menggunakan T-RFLP. Pada penelitian ini juga dilakukan analisis T-RFLP untuk melihat pengaruh perlakuan perendaman dalam povidone iodine terhadap komunitas bakteri pada larva udang putih.
Karena ketatnya regulasi di beberapa negara pasar utama komoditas udang, produsen berusaha mengurangi kandungan total bakteri atau bakteri tertentu pada produk udang. Beberapa cara yang digunakan adalah antara lain dengan perlakuan fisik maupun kimia. Penggunaan senyawa antibakteri berupa antibiotik dihindari karena adanya pembatasan kandungan antibiotik pada produk perikanan karena dianggap menyebarkan resistensi. Salah satu cara yang umum digunakan dalam produksi benur di hatchery
komersial adalah perendaman telur dan nauplii dalam larutan disinfektan. Penggunaan senyawa disinfektan dalam akuakultur diatur secara ketat di berbagai negara. Senyawa yang digunakan harus efektif, aman dan efisien dari segi biaya. Beberapa senyawa yang umum digunakan dalam akuakultur sebagai disinfektan adalah povidone iodine, formalin, hydrogen peroxide, and glutaraldehyde.
Povidone iodine (selanjutnya disebut iodine) merupakan salah satu senyawa yang dapat digunakan dalam akuakultur dengan peraturan yang relatif tidak terlalu ketat. Perlakuan ini dilaksanakan saat pemanenan untuk pemindahan telur ke hatching tank
maupun pemindahan nauplii ke rearing tank dan bertujuan untuk meminimalisir bakteri yang dapat ditransfer kepada larva yang kemungkinan berbahaya bagi kelangsungan hidupnya. Beberapa penelitian sebelumnya menunjukkan perlakuan ini efektif menurunkan jumlah bakteri yang dapat dikultur dan tidak mempengaruhi hatching rate
maupun survival rate dari larva beberapa jenis ikan (Katharios et al, 2007; Eissa et al., 2007) dan L. vannamei (Cooney et al., 2005). Perendaman telur dalam iodine dapat mengurangi kemungkinan transfer patogen secara vertikal dari induk yang terinfeksi kepada keturunannya (Eissa et al., 2007) karena transmisi patogen dapat terjadi melalui permukaan telur yang terkontaminasi. Akan tetapi, sejauh mana pengaruh perlakuan ini terhadap keseluruhan komunitas bakteri yang berasosiasi belum diketahui, mengingat sebagian besar bakteri yang berasosiasi dengan larva udang diduga unculturable.
Hasil perhitungan total bakteri yang berasosiasi dengan telur dan larva udang putih selama tahapan perkembangannya pada kelompok larva yang diberi perlakuan iodine menunjukkan jumlah yang lebih kecil dibanding larva yang tidak diberi perlakuan seperti terlihat pada Gambar 12. Penurunan jumlah total bakteri sekitar 98% pada telur dan 93% pada nauplii terjadi setelah perendaman dalam iodine 20 ppm selama 20 detik. Akan tetapi jumlah total bakteri kemudian mulai pulih mendekati jumlah total bakteri pada kelompok larva tanpa perlakuan pada tahapan perkembangan larva selanjutnya. Hal ini menunjukkan bahwa pengaruh iodine terhadap jumlah total bakteri hanya bersifat sementara saja, yaitu sesaat setelah pemberian perlakuan, karena iodine hanya digunakan untuk merendam telur dan nauplii saat akan dipindahkan ke tangki baru dan tidak ditambahkan secara terus menerus.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 E5 N Z M PL Lo g C FU /g tanpa iodine iodine
Gambar 12. Jumlah total bakteri pada udang tanpa dan dengan perlakuan iodine. E5: Telur 5 jam setelah spawning; N : Nauplii; Z : Zoea; M : Mysis; PL : Post larva
Sementara untuk kelompok Vibrio, jumlahnya pada larva yang diberi perlakuan iodine lebih rendah dibandingkan kelompok tanpa perlakuan iodine, tapi penurunannya tidak sebesar pada total bakteri dan hanya terjadi sesaat setelah perlakuan pada telur sampai tahap zoea (Gambar 13.). Vibrio tidak dapat terdeteksi pada telur yang diberi perlakuan, tetapi kemungkinan hal ini disebabkan karena jumlah Vibrio pada larva yang tidak diberi perlakuan juga kecil. Pada nauplii, iodine menurunkan jumlah Vibrio sebesar 67% pada kelompok larva yang diberi perlakuan. Akan tetapi, jumlah Vibrio dengan cepat mengalami pemulihan, bahkan sempat melebihi kelompok yang tidak diberi iodine pada tahap mysis, dan kembali lebih rendah di tahap PL dengan selisih jumlah yang tidak terlalu besar. Hal ini juga menguatkan bahwa efek iodine hanya sementara dan kemungkinan iodine tidak terlalu mempengaruhi pertumbuhan kelompok Vibrio. Seperti telah disebutkan sebelumnya, peningkatan jumlah Vibrio terjadi terutama setelah pemberian Artemia sebagai pakan larva pada tahap mysis, sehingga perlakuan perendaman dalam iodine ini kemungkinan tidak terlalu efektif untuk melindungi larva dari kelompok Vibrio karena diterapkan hanya pada awal perkembangan larva.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 E5 N Z M PL L o g CF U/ g tanpa iodine iodine
Gambar 13. Jumlah total Vibrio pada udang tanpa dan dengan perlakuan iodine. E5 : Telur 5 jam setelah spawning; N : Nauplii; Z : Zoea; M : Mysis; PL : Post larva
Pengaruh iodine terhadap keragaman komunitas bakteri yang dapat dikultur terlihat pada Gambar 14. Sesaat setelah perlakuan perendaman dengan iodine, terjadi perubahan pada komposisi komunitas yang berasosiasi dengan telur dan nauplii. Akan tetapi, iodine tidak mengubah kekayaan spesies yang ditemukan, hanya jumlah relatif dari beberapa isolat yang berhasil dikultur. Iodine menekan pertumbuhan Pseudoalteromonas sp. 10Xb1, Paracoccus zeaxanthinifaciens strain R-1506, Alteromonas sp. DG1302, dan
Microbacterium sp. SMB18 sehingga menyebabkan populasi Alteromonas sp. SPB-5 dan
Exiguobacterium sp. JL-42 menjadi lebih dominan. Sementara satu isolat,
Flavobacteriaceae bacterium P99-3, sepertinya tidak dipengaruhi iodine. Walaupun pengaruh iodine pada jumlah total bakteri hanya bersifat sementara, pengaruhnya pada keragaman dalam komunitas bakteri yang berasosiasi dengan larva udang putih dapat berlangsung sampai akhir perkembangan larva.
Secara umum iodine menekan pertumbuhan sebagian besar bakteri yang berasosiasi dengan telur dan larva, sehingga menyebabkan keseimbangan dalam komunitas berubah. Iodine menjadi agen seleksi bagi jenis bakteri tertentu, yang menentukan apakah jenis tersebut dapat bertahan dalam komunitas pada tahap perkembangan larva berikutnya. Pada tahap perkembangan larva berikutnya, komposisi komunitas bakteri tetap memiliki perbedaan antara kelompok larva yang diberi iodine dan yang tidak. Hal ini perlu mendapat perhatian karena bisa saja perlakuan ini justru
menyebabkan bakteri yang menguntungkan terhambat pertumbuhannya. Jika hal ini terjadi, yang kemudian berkembang dominan adalah bakteri patogen oportunis sehingga mengancam kelangsungan hidup larva.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
E5 E5(i) Nauplii Nauplii(i) Zoea Zoea(i) Mysis Mysis(i) PL PL(i)
Microbacterium sp. SMB18 Paracoccus zeaxanthinifaciens strain R-1506 Exiguobacterium sp. JL-42 Pseudoalteromonas sp. 10Xb1
Flavobacteriaceae bacterium P99-3 Alteromonas sp. SPB-5 Alteromonas sp. DG1302
Gambar 14. Komposisi komunitas bakteri yang berasosiasi dengan udang tanpa dan dengan perlakuan iodine. i=diberi perlakuan iodine.
Keragaman kelompok Vibrio yang berasosiasi dengan larva juga dipengaruhi oleh perlakuan iodine (Gambar 15.). Tampaknya iodine mempengaruhi pertumbuhan Vibrio
dengan warna koloni hijau di medium TCBS. Koloni berwarna hijau absen di seluruh tahapan perkembangan larva yang diberi perlakuan perendaman iodine. Karena koloni hijau bukanlah yang dominan pada kelompok Vibrio yang berasosiasi dengan larva udang putih, maka kemungkinan hal ini juga menyebabkan perlakuan perendaman dengan iodine tidak terlalu mempengaruhi jumlah total Vibrio.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
E 5 E 5(i) Nauplii Nauplii(i) Zoea Zoea(i) Mysis Mysis(i) PL
Koloni kuning Koloni hijau
Gambar 15. Komposisi Vibrio yang berasosiasi dengan udang tanpa dan dengan perlakuan iodine. i=diberi perlakuan iodine.
Dari hasil di atas terlihat bahwa iodine dapat mengurangi kandungan bakteri dan mengubah komposisi komunitas bakteri yang dapat dikulturkan. Untuk melihat pengaruhnya terhadap komunitas secara keseluruhan diperlukan teknik yang berbasis molekular, yaitu analisis T-RFLP yang juga dilakukan pada sampel yang sama. Pengaruh iodine terhadap jumlah total bakteri berdasarkan total luas peak area TRF dapat dilihat pada Gambar 16. Secara umum sepanjang perkembangan larva jumlah bakteri pada larva yang diberi perlakuan iodine lebih rendah dibandingkan yang tanpa diberi perlakuan. Jumlah bakteri turun cukup besar sesaat setelah perlakuan dengan iodine pada telur, sekitar 63%. Akan tetapi penurunan jumlah total bakteri tidak terlalu besar pada tahap nauplii, hanya sekitar 6%. Karena kelompok bakteri yang dominan pada telur dan nauplii berbeda, hal ini menunjukkan bahwa kemungkinan jenis bakteri yang dominan pada tahap nauplii tidak terpengaruh pertumbuhannya oleh iodine.
0 50000 100000 150000 200000 250000 E0 E5 N Z M PL Total P eak Ar ea
iodine tanpa iodine
Gambar 16. Perkiraan jumlah total bakteri tanpa dan dengan perlakuan iodine berdasarkan total peak area TRF. E0 : Telur sesaat setelah spawning; E5 : Telur 5 jam setelah spawning; N : Nauplii; Z : Zoea; M : Mysis; PL: Post larva
Dari segi keragamannya, kelompok larva yang diberi perlakuan iodine memiliki keragaman yang lebih rendah dibandingkan larva tanpa perlakuan kecuali pada tahap zoea (Tabel 13.). Iodine mengubah komposisi komunitas bakteri yang berasosiasi dengan larva udang putih dan terus berlangsung sampai tahap perkembangan lanjut dari larva (Gambar 17). Beberapa filotipe tertekan jumlahnya sementara yang lain menjadi lebih banyak. Pada tahap akhir perkembangan, yaitu post larva, hanya 2 filotipe yang terdeteksi untuk kelompok larva yang diberi perlakuan iodine. Akan tetapi, belum jelas apakah hal ini disebabkan perlakuan perendaman iodine saat pemanenan telur dan nauplii atau adanya variasi akibat tangki pemeliharaan yang berbeda. Antara larva yang diberi perlakuan iodine dan yang tidak memang dipelihara pada tangki yang terpisah walau awalnya berasal dari induk yang sama dan dipelihara dalam kondisi yang sama.
Tabel 13. Keragaman komunitas bakteri yang berasosiasi dengan tahapan perkembangan larva udang putih tanpa dan dengan perlakuan iodine.
Richness Weiner / H’ Tanpa iodine iodine Tanpa iodine iodine Tanpa iodine iodine Telur 18 8 2.18 1.68 0.75 0.81 Nauplii 14 5 1.33 0.71 0.5 0.44 Zoea 8 18 1.19 1.53 0.57 0.53 Mysis 18 10 2.55 1.99 0.88 0.86 PL 18 2 2.58 0.64 0.89 0.93 0% 20% 40% 60% 80% 100%
E0 E 5 E5(i) N N(i) Z Z(i) M M(i) PL PL(i)
38 70 73 76 80 82 83 96 104 130 136 137 142 148 150 153 154 157 162 182 191 193 203 204 206 207 213 219 228 230 231 234 235 238 243 245 247 251 252 254 257 260 261 262 270 272 276 293 294 304 305 309 337 342 344 346 382 396 448
Gambar 17. Perbandingan komposisi TRF Sau3A1 selama tahapan perkembangan larva tanpa dan dengan perlakuan iodine. E0 : Telur sesaat setelah spawning; E5 : Telur 5 jam setelah spawning; N : Nauplii; Z : Zoea; M : Mysis; PL : Post larva ; i : diberi perlakuan iodine.
Untuk mengetahui filotipe apa saja yang terpengaruh oleh perlakuan iodine, dapat dilihat pada komunitas bakteri yang berasosiasi dengan telur dan nauplii. Komunitas bakteri pada telur yang baru saja spawning dan 5 jam berikutnya relatif sama pada kelompok yang tidak direndam iodine. Sedangkan pada telur yang direndam iodine terdapat perbedaan komposisi filotipe yang ada. Ada filotipe yang jumlahnya tertekan dan bahkan hilang, yang berarti filotipe ini sensitif terhadap iodine. Sementara itu, pada nauplii yang diberi perlakuan dengan iodine juga memiliki perbedaan dengan yang tanpa perlakuan. Perlakuan iodine menyebabkan turunnya keragaman komunitas bakteri pada telur maupun nauplii. Beberapa filotipe yang kemungkinan sensitif terhadap iodine dapat
dilihat pada Tabel 14 sementara yang resisten terhadap iodine dapat dilihat pada Tabel 15. Sebagian besar filotipe yang sensitif terhadap perlakuan iodine kemungkinan tergolong dalam grup Proteobacteria. Kelompok ini memang dominan pada telur sehingga perlakuan iodine menurunkan jumlah total bakteri dengan cukup signifikan pada tahap ini, seperti terlihat pada Gambar 17. Sementara pada nauplii, yang dominan adalah filotipe dengan ukuran TRF 245 bp, yang terlihat resisten terhadap perlakuan iodine ini, sehingga perlakuan yang sama hanya sedikit mempengaruhi jumlah total bakteri yang berasosiasi dengan nauplii.
Tabel 14. Filotipe yang sensitif terhadap iodine Ukuran TRF Grup 344 Bacteroidetes 260 Bacteroidetes 254 Firmicutes 251 Firmicutes 243 -Proteobacteria 235 -Proteobacteria 234 -Proteobacteria 230 -Proteobacteria 219 α-Proteobacteria 204 α-Proteobacteria 162 α-Proteobacteria 157 Bacteroidetes 153 α-Proteobacteria 150 Bacteroidetes
96 Tidak ada kecocokan dengan database 83 Tidak ada kecocokan dengan database 76 α-Proteobacteria
73 Firmicutes 38 Firmicutes
Dari hasil ini terlihat bahwa povidone iodine memiliki efek yang berbeda pada berbagai kelompok bakteri yang berasosiasi dengan larva udang putih. Selain mengubah tingkat keragaman (indeks Shannon-Wiener), hal ini juga menyebabkan berubahnya frekuensi distribusi dalam komunitas, seperti ditunjukkan oleh nilai E (evenness). Pada telur, walaupun tingkat keragaman komunitas bakteri yang berasosiasi turun, nilai
evenness justru meningkat setelah perlakuan dengan povidone iodine, yang berarti distribusi filotipe-filotipe yang ada dalam komunitas menjadi lebih merata. Hal ini
disebabkan karena filotipe yang dominan pada telur sensitif terhadap iodine sehingga jumlahnya tertekan dan menjadi kurang dominan. Hal sebaliknya terlihat pada nauplii. Baik tingkat keragaman maupun evenness komunitas bakteri yang berasosiasi dengan nauplii turun akibat perlakuan iodine. Hal ini karena filotipe yang dominan pada nauplii resisten terhadap iodine, sehingga malah menjadi semakin dominan dan menyebabkan distribusi filotipe dalam komunitas semakin tidak merata.
Tabel 15. Filotipe yang resisten terhadap iodine Ukuran TRF Grup 270 Firmicutes 252 Firmicutes 245 Bacteroidetes 228 -Proteobacteria 193 α-Proteobacteria 154 -Proteobacteria 130 α-Proteobacteria
Hal yang berbeda terjadi pada tahap zoea. Tingkat keragaman komunitas bakteri yang berasosiasi dengan larva pada kelompok yang diberi perlakuan justru lebih besar dibandingkan kelompok yang tidak diberi perlakuan. Walaupun iodine hanya berefek sementara, senyawa ini kemungkinan juga dapat mempengaruhi pembentukan komunitas bakteri yang berasosiasi dengan tahapan perkembangan larva selanjutnya. Iodine menghambat pertumbuhan beberapa kelompok bakteri sehingga menyebabkan kelompok lainnya menjadi lebih dominan. Hal ini menentukan jumlah bakteri yang menginisiasi pembentukan komunitas bakteri selanjutnya. Ada beberapa filotipe yang bertahan dari perlakuan iodine pada tahap nauplii yang kemudian masih bisa ditemukan pada tahap zoea, tetapi pada kelompok larva yang tidak diberi perlakuan tidak dapat dideteksi. Perbedaan pada jumlah inisiasi menentukan filotipe mana yang dapat terus bertahan dalam komunitas selanjutnya.
Secara umum, povidone iodine terbukti efektif sebagai disinfektan yang dapat menurunkan kandungan bakteri pada telur/larva udang putih. Akan tetapi senyawa ini hanya memiliki efek dalam jangka pendek. Selain itu, efek yang berbeda untuk berbagai kelompok bakteri juga perlu mendapat perhatian, karena tidak mustahil perlakuan ini malah berbalik menimbulkan efek negatif jika menyebabkan bakteri yang