4.3. ANALISA HASIL FERMENTASI
4.3.7. Asam-asam Organik Biji Kopi Hasil Fermentasi
Fermentasi merupakan sebuah proses metabolisme yang dilakukan oleh mikroorganisme untuk memperoleh energi dengan mengubah gula saat fermentasi, kebanyakan gula diubah menjadi glukosa dan fruktosa. Menurut Daulay dan Rahman (1992), pada proses fermentasi minuman beralkohol, gula diubah menjadi alkohol, asam-asam organik, gliserol dan gas CO2. Pada proses metabolilesme terjadi sintesis karbohidrat, asam lemak, dan asam amino untuk mendapatkan mendapatkan ATP (Liesbetini 2010).
Adanya proses degradasi pada kulit kopi selama proses fermentasi menggunakan bakteri FLX 3, FLP 1 dan FLS 1 juga akan berdampak pada perubahan komponen asam-asam organik pada biji kopi. Hal ini dapat dilihat dari hasil analisa asam-asam organik (Tabel 13). Menurut Pangabean (2011), fermentasi kopi yang terjadi dalam perut luwak terjadi dengan bantuan enzim yang terdapat pada perut luwak yang komposisinya bervariasi dan kompleks sehingga dampaknya terhadap komponen asam-asam organik biji kopi juga bervariasi.
32
Asam-asam organik yang dianalisa antara lain adalah vitamin C, asam butirat, asam laktat, asam oksalat, dan kafein. Analisa dilakukan pada biji kopi hasil perlakuan terbaik pada setiap perlakuan yang diperoleh berdasarkan hasil analisa aktivitas enzim, susut bobot, gula total, gula pereduksi, kadar protein, aktivitas spesifik enzim, dan derajat polimerisasi.
Asam askorbat atau vitamin C merupakan vitamin yang dapat larut dalam air dan sangat penting untuk biosintesis kologen, karnitin, dan berbagai neurotransmitter. Kebanyakan tumbuh-tumbuhan dan hewan dapat mensintesis asam askorbat untuk kebutuhannya sendiri. Oleh sebab itu asam askorbat harus disuplai dari luar tubuh terutama dari buah, sayuran, atau tablet suplemen Vitamin C. Vitamin C dapat berbentuk asam askorbat dan asam L-dehidroaskorbat, keduanya memiliki keaktifan sebagai vitamin C. Asam askorbat mudah teroksidasi secara reversibel menjadi L-dehidroaskorbat. L-dehidroaskorbat secara kimia sangat labil dan dapat mengalami perubahan lebih lanjut menjadi asam L-diketogulonat yang tidak lagi memiliki keaktifan sebagai vitamin C. Asam D-askorbat atau vitamin C disintesis oleh semua tanaman berklorofil dan pada hati atau ginjal hewan mamalia, amfibi, reptil dan sebagian besar burung. Terdapat dua jalur sintesis asam askorbat yaitu jalur glukosa-glukuronic-gulonik dan jalur galaktosa-galakturonat-galaktonolakton. Sedangkan pada hewan, asam askorbat paling banyak dihasilkan dari L-glukosa (Gambar 10). Banyak keuntungan di bidang kesehatan yang didapat dari fungsi askorbat, seperti fungsinya sebagai antioksidan, anti atherogenik, immunomodulator dan mencegah flu. Akan tetapi untuk dapat berfungsi dengan baik sebagai antioksidan, maka kadar asam askorbat ini harus terjaga agar tetap dalam kadar yang relatif tinggi di dalam tubuh (Naidu 2003).
Pada hasil analisa asam askorbat (Tabel 13) menunjukan bahwa perlakuan jumlah isolat xilanolitik berpengaruh terhadap kandungan asam askorbat pada biji kopi hasil fermentasi. Pada saat jumlah isolat xilanolitik diturunkan, maka kandungan asam askorbat pada biji hasil fermentasi juga menurun. Nilai asam askorbat perlakuan pertama menggunakan 10% isolat FLX 3 nilainya lebih besar dari perlakuan kedua yang menggunakan 5% isolat dan nilai asam nilai asam askorbat perlakuan kedua lebih besar dari perlakuan ketiga yang hanya menggunakan 3.4 % isolat FLX 3.
33
Asam butanoat atau asam butirat memiliki struktur kimia CH3(CH2)2CO2H. Butirat menunjukan kemampuan untuk menghambat pertumbuhan kanker kolorektal. Beberapa penelitian menyebutkan bahwa butirat dapat menghambat pertumbuhan sel-sel kanker kolorektal dengan cara menghambat proliferasi sel, serta meningkatkan kemampuan diferensiasi dan apoptosis sel (Elvira 2008). Proses pembentukan asam butirat pada proses fermentasi diawali oleh oleh proses pemecahan glukosa menjadi piruvat pada tahapan Lintasan Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) dimana setelah tahapan ini dihasilkan 4 elektron dan 2 ATP. Piruvat didekarboksilasi menjadi asetil KoA dan CO2. Dua molekul asetil KoA dan CO2 berkondensasi menghasilkan asetoasetil KoA. Asetoasetil KoA direduksi menjadi Beta-hidroksibutiril KoA. Beta-Hidroksibutiril KoA didehidrasi menjadi krotonil KoA oleh krotonase. Krotonil KoA direduksi menjaadi butiril KoA oleh butiril KoA dehidrogenase. Penggantiaan gugus KoA oleh fosfat mengakibatkan butiril KoA menjadi butiril fosfat. Butiril fosfat didefosforilasi menjadi butirat. Penambahan isolat selulolitik pada fermentasi kopi berdasarkan hasil analisa asam butirat menunjukkan bahwa peningkatan asam butirat yang di hasilkan cukup signifikan di bandingkan perlakuan lain dan kandungan asam butirat dari kopi luwak alami dan kopi arabika asli. Kandungan asam butirat pada perlakuan ketiga 34 kali lebih besar dibandingkan dengan hasil analisa asam butirat kopi luwak asli. Hasil ini menunjukakan bahwa enzim selulase yang diproduksi oleh isolat FLS 1 selain menguraikan polisakarida pada kopi menjadi gula-gula sederhana tetapi juga menguraikan polisakarida menjadi selulosa pada kulit kopi menjadi glukosa yang kemudian dikonversi kembali menjadi asam butirat.
Asam laktat (lactic acid) adalah salah satu asam organik yang penting diindustri, terutama di industri makanan, mempunyai nama IUPAC: asam 2-hidroksipropanoat (CH3-CHOH-COOH). Asam laktat adalah asam buah yang merupakan salah satu dari Alpha-hdroxy Acid (AHA) yaitu komponen yang mengandung rantai hidroksi di posisi alfa. (Limin et al 2010). Pada proses fermentasi produksi asam laktat dimulai pada saat metabolisme memasuki fase glikolisis. Sebuah molekul glukosa dioksidasi menjadi dua molekul asam piruvat. Pada tahapan selanjutnya duamolekul asam piruvat yang tereduksi oleh dua molekul NADH untuk membentuk dua molekul asam laktat. Karena asam laktat adalah produk akhirpada reaksi tersebut maka tidak mengalami oksidasi lebih lanjut, dan sebagian besar energi dihasilkan oleh reaksi tetap disimpan dalam asam laktat.Dengan demikian, fermentasi ini menghasilkan hanya sejumlahkecil energi (Liesbetini 2010). Asam laktat dan asam butirat merupakan asam organik hasil proses metabolisme sehingga pada hasil analisa asam laktat biji kopi hasil fermentasi
terdapat kesamamaan dampak penambahan isolat selulolitik. Penambahan isolat selulolitik pada
fermentasi kopi mengakibatkan adanya peningkatan asam laktat yang dihasilkan cukup signifikan dibandingkan perlakuan lain, kandungan asam laktat dari kopi luwak alami dan kopi arabika asli. Kandungan asam laktat pada perlakuan ketiga jauh lebih besar dibandingkan dengan hasil analisa asam laktat kopi luwak asli ataupun kopi arabika. Hasil ini menunjukakan bahwa enzim selulase yang diproduksi oleh isolat FLS 1 selama proses fermentasi berlangsung selain mampu mengkonversi selulosa menjadi asam butirat tetapi juga mampu mengoksidasi glukosa sehingga pada akhirnya terbentuk asam laktat.
Asam oksalat adalah asam dikarboksilat yang hanya tersusun atas dua atom C pada masing-masing molekul, sehingga dua gugus karboksilat berada berdampingan. Karena letak gugus karboksilat yang berdekatan, asam oksalat mempunyai konstanta dissosiasi yang lebih besar daripada asam-asam organik lain. Menurut Liesbetini (2010), biosintesa asam oksalat telah dipelajari pada berbagai golongan organisme dan yang paling banyak dilaporkan dan dipelajari adalah sintesa asam oksalat pada tumbuhan dan mikroorganisme termasuk protozoa, bakteri dan
34
jamur. Pada jamur oksalat disintesis oleh dua jenis enzim intraseluler, yaitu glioksilat dehidrogenase (GLOXDH) dan oksaloasetase (OXA). Enzim-enzim ini menggunakan senyawa-senyawa perantara yang terlibat dalam siklus asam karboksilat (siklus Krebs) dan glioksilat (siklur Kornberg) seperti yang terlihat pada gambar 11.
Reaksi yang pertama adalah reaksi oksidasi, dimana enzim GLOXDH mengoksidasi glioksilat untuk membentuk oksalat sedangkan reaksi yang kedua adalah reaksi hidrolisis, dimana enzim OXA menghidrolisis oksaloasetat yang memiliki empat atom karbon dan menghasilkan oksalat dan asetat yang masing-masingnya memiliki 2 atom karbon (Munir 2005)
Asam oksalat pada hasil fermentasi kopi menunjukkan bahwa isolat pendegradasi xilan (FLX 3) dan selulosa (FLS 1) mensintesis xilan dan selulosa menjadi glukosa sehingga dalam metabolisme kedua isolat tersebut mendapatkan sumber energi. Semakin kecil asam oksalat yang terbentuk hal maka semakin baik isolat tersebut mendegradasi selulosa ataupun xilan karena kecilnya asam oksalat yang terbentuk semakin banyak asam oksalat yang disintesis dalam siklus krebs menjadi asam sitrat yang selanjutnya disintesis menjadi ATP. Hal ini sesuai dengan gambaran siklus metabolisme yang disampaikan oleh Bailey dan Ollis (1988) (Gambar X). Hasil analisa asam oksalat biji kopi hasil fementasi menunjukkan bahwa penambahan isolat selulolitik dan isolat proteolitik seperti yang dilakukan pada perlakuan ketiga memberikan dampak penurunan asam oksalat yang lebih tinggi dibandingkan penurunan asam oksalat yang terjadi apabila kopi arabika tersebut di fermentasi dalam perut luwak. Semakin rendah asam oksalat maka semakin baik kualitas biji kopi. Pada dosis 4-5 gram asam oksalat atau kalium oksalat dapat menyebabkan kematian pada orang dewasa, tetapi biasanya jumlah yang menyebabkan pengaruh fatal adalah antara 10 dan 15 gram. Gejala pada pencernaan (pyrosis, abdominal kram, dan muntah-muntah) dengan cepat diikuti kegagalan peredaran darah dan pecahnya pembuluh darah inilah yang dapat menyebabkan kematian (Bandna et al. 2012).
35
Kafein adalah alkaloid yang tergolong dalam keluarga methylxanthine bersama sama senyawa tefilin dan teobromin, berlaku sebagai perangsang sistem saraf pusat. Pada keadaan asal, kafein adalah serbuk putih yang pahit dengan rumus kimianya C6H10O2, dan struktur kimianya 1,3,7- trimetilxantin (Maughan dan Griffin 2003).
Hasil analisa kadar kafein biji kopi hasil fermentasi menunjukan bahwa kadar kafein pada biji kopi yang di fermentasi dipengaruhi oleh dua jenis isolat yaitu isolat xilanolitik dan proteolitik. Kulit kopi mengandung xilan dan protein akan tetapi jumlahnya tidak sebanyak selulosa. Pada perlakuan pertama hanya diinokulasikan isolat xilanolitik terlihat penurunan kadar kafein yang sangat signifikan.Hal ini terjadi karena pada saat proses metabolisme bakteri FLX 3 kebutuhan substrat xilan sebagai sumber energi telah habis disintesis sehingga untuk mendapatkan energi baru isolat FLX 3 mendegradasi kafein yang terdapat pada kopi sehingga terjadi penurunan kadar kafein. Dalam metabolisme bakteri ketika karbohitrat sebagai sumber energi tidak tersedia maka sel pada bakteri akan mengkonversi lemak ataupun protein. Dalam metabolisme tahapan ini disebut tahapan sintesis asam lemak dan sintesis asam amino (Liesbetini 2010). Bukti lain yang menunjukkan bahwa isolat FLX 3 berperan dalam penurunan kafein pada biji kopi adalah terjadinya penurunan hasil analisa kadar kafein ketika jumlah isolat xilanolitik diturunkan dari 10% menjadi 5% akibat adanya penambahan isolat FLP 1. Penambahan isolat Proteolitik (FLP 1) juga berpengaruh pada perubahan kadar protein kopi. Hal ini dapat terbukti dari penurunan kadar kafein yang sedikit lebih kecil daripada perlakuan pertama. Apabila isolat FLX 3 diperkecil dan isolat FLP 1 juga diperkecil maka penurunan kadar kafein juga akan semakin kecil. Hal ini dapat dilihat dari hasil analisa kadar kafein perlakuan ketiga. Sebagai isolat proteolitik, bakteri FLP 1tentunya akan mendegradasi kafein pada kopi untuk mendapatkan energi. Menurut Pangabean (2011) kopi luwak digemari karena keistimewaannya yang memiliki kandungan kaffein yang lebih rendah di bandingkan dengan jenis kopi lain. Berdasarkan hasil analisa kadar kafein dapat dilihat bahwa fermentasi kopi menggunakan isolat yang diisolasi dari kotoran luwak dapat menurun kadar kadar kafein lebih tinggi dibandingkan fermentasi dalam perut luwak.
Tabel 13. Hasil analisa asam-asam organik biji kopi
Sampel Asam Askorbat
(mg/100g) Asam Butirat (%) Asam Laktat (%) Asam Oksalat (ppm) Kafein (mg/100g) Kopi + FLX3 70.94 0.0674 0.1014 4746.90 660.95 Kopi + FLX3 + FLP1 65.12 0.0432 0.1176 1176.26 705.45 Kopi+ FLX3+FLS1+FLP1 43.29 0.28 1.33 776.65 901.62 Kopi Arabika 22.46 0.0072 0.0074 3000 1885.78 Kopi Luwak 20.28 0.0082 0.0026 1700 1342.60
36
Gambar 12. Persentase penurunan kadar kafein biji kopi
Nilai asam-asam organik yang diperoleh pada biji kopi hasil fermentasi adalah nilai asam-asam organik biji kopi yang hanya melewati tahapan fermentasi dalam proses pengolahan kopi menjadi kopi yang dapat dikonsumsi. Agar dapat dikonsumsi biji kopi harus melewati tahapan penyangraian. Ketika proses penyangraian reaksi kimia akan terjadi pada biji kopi. Biji kopi dapat mengalami proses karamelisasi saat penyangraian. Jadi, nilai-nilai asam organik pada biji kopi yang hasil fermentasi akan mengalami proses kimia yang dapat berpengaruh pada cita rasa dan aroma.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70%
Kopi + FLX3 Kopi + FLX3 + FLP1 Kopi + FLX3 + FLP1 + FLS1 Kopi Luwak
65 %
63 %
29 % 52 %
37
V. SIMPULAN DAN SARAN
5.1. SIMPULAN
Berdasarkan hasil karakterisasi bakteri proteolitik Bacillus aerophilus dan Stenotropomonas sp MH3, Bacillus aerophilus terpilih sebagai bakteri proteolitik terbaik untuk digunakan sebagai isolat dalam fermentasi kopi. Bakteri FLP 1 memiliki kemampuan untuk tumbuh dan menghasilkan enzim lebih tinggi
Nilai optimum untuk aktivitas enzim, susut bobot, gula pereduksi, gula total, dan derajat polimerisasi diperoleh pada suhu optimum fermentasi 37o C untuk fermentasi menggunakan bakteri xilanolitik dan fermentasi dengan kombinasi isolat xilanolitik dengan isolat proteolitik adalah 37o C. Pada perlakuan kombinasi isolat xilanolitik, selulolitik, dan proteolitik diperoleh suhu optimum yang berbeda yaitu pada suhu 30o C. Lama masa inkubasi untuk semua perlakuan untuk mendapatkan hasil optimum adalah 72 jam.
Setiap perlakuan memberikan dampak perubahan nilai-nilai asam organik pada biji kopi yang signifikan. Perlakuan fermentasi menggunakan isolat xilanolitik memberikan peningkatan asam askorbat serta penurunan kadar kafein tertinggi. Peningkatan asam butirat dan asam laktat serta penurunan asam oksalat tertinggi diperoleh pada perlakuan fermentasi menggunakan ketiga isolat.
5.2. SARAN
Produksi kopi luwak sintesis dengan perlakuan fermentasi kopi yang diinokulasikan kombinasi Stenotropomonas sp MH34, Proteus penneri, dan Bacillus aerophilusyang diinkubasi pada suhu 30o C selama 72 jam merupakan salah satu alternatif untuk mendapatkan kopi sintesis yang proses fermentasinya menyerupai fermentasi dalam perut luwak. Kendala yang perlu dihadapi adalah masalah tingkat produksi. Untuk peneliti selanjutnya yang berminat diharapkan mencoba untuk melakukan scale-up produksi kopi luwak sintesis ini dan mencoba mengatur komposisi setiap isolat.