PENGENDALI BIOLOGI PATOGEN TUMBUHAN
10. Bacillus thuringiensis
B. thuringiensis ditemukan pertama kali pada tahun 1911 sebagai patogen pada ngengat (our moth) dari Provinsi Thuringia, Jerman. Bakteri ini digunakan sebagai bahan aktif produk insektisida komersial pertama kali pada tahun 1938 di Perancis dan kemudian di Amerika serikat (1950). Tahun 1960-an, bahan aktif produk tersebut diganti dengan galur bakteri yang lebih patogenik dan efektif melawan berbagai jenis insekta (Deacon, 1998).
Keberadaan inklusi paraspora dalam B. thuringiensis telah ditemukan sejak tahun 1915, namun komposisi protein penyusunnya baru diketahui pada tahun 1915. Tahun 1953, Hannay, mendeteksi struktur kristal pada inklusi paraspora yang mengandung lebih dari satu macam protein kristal insektisida (insecticidal crystal protein, ICP) atau disebut juga delta endotoksin. Berdasarkan komposisi ICP penyusunnya, kristal tersebut dapat membentuk bipiramida, kuboid, romdoid datar, atau campuran dari beberapa tipe Kristal (Deacon, 1998).
Berbagai macam spesies B. thuringiensis telah diisolasi dari serangga golongan koleoptera, diptera, dan Lepidoptera, baik yang sudah mati ataupun dalam kondisi sekarat. Bangkai serangga sering mengandung spora dan ICP B. thuringiensis dalam jumlah besar.
Sebagian subspesies juga didapatkan dari tanah, permukaan daun, dan habitat lainnya. Dalam keadaan kondisi lingkungan yang baik dan nutrisi cukup, spora bakteri ini dapat terus hidup dan melanjutkan pertumbuhan vegetatifnya (WHO, 1999). B. thuringiensis dapat ditemukan pada berbagai jenis tanaman, termasuk sayuran, kapas, tembakau, dan tanaman hutan.
B. thuringiensis termasuk kerajaan Eubacteria, lum Firmicutes, kelas Bacilli, ordo Bacillales, famili Bacillaceae, genus Bacillus. B. thuringiensis dibagi menjadi 67 subspesies (hingga tahun 1998) berdasarkan serotipe dari agella. Ciri khas dari bakteri ini yang membedakannya dengan spesies Bacillus lainnya adalah kemampuan membentuk kristal paraspora yang berdekatan dengan endospora selama fase sporulasi III dan IV. Sebagian besar ICP disandikan oleh DNA plasmid yang dapat ditransfer melalui konjugasi antar galur B. thuringiensis, maupun dengan bakteri lain
100
yang berhubungan. Selama pertumbuhan vegetatif terjadi, berbagai galur B. thuringiensis menghasilkan bermacam-macam antibiotik, enzim, metabolit, dan toksin, yang dapat merugikan organisme lain.
Selain endotoksin (ICP), sebagian subspesies B. thuringiensis dapat membentuk beta-eksotoksin yang toksik terhadap sebagian besar makhluk hidup, termasuk manusia dan insekta (WHO, 1999).
Sifat-sifat B. thuringiensis adalah gram positif, aerob, tetapi dapat bersifat anaerob fakultatif (Steinhouse, 1976 dalam Prabowo, 1990). Bakteri-bakteri tersebut mempunyai sel berbentuk batang dengan ukuran lebar 1,0-1,2 mikron dan panjang 3-5 mikron, membentuk endospora, suhu untuk pertumbuhan minimum 10-15 C o
dan maksimum 40-45 C (Holt, 1972 dalam Prabowo, 1990). B. o
thuringiensis membentuk spora yang berbentuk oval, terletak di dekat ujung sel, berwarna hijau kebiruan dan berukuran 1-1,3 mikron.
Pembentukan spora terjadi dengan cepat pada suhu 35-37 C. Spora o
ini mengandung asam dipikolinin, yaitu suatu komplek senyawa Ca dan peptidoglikan. Spora ini relatif tahan terhadap pengaruh sik dan kimia (Pelczar, 1978 dalam Prabowo, 1990). Beberapa larva Lepidoptera yang mempunyai pH saluran makanan di atas 9, spora yang berkecambah tidak dapat hidup dan sel vegetatifnya cepat hancur. Namun jika pH saluran turun, bekteri yang bertahan pada spesies tersebut dapat tumbuh dan menginfeksi inang (Burgenjon dan Martouret, 1971 dalam Prabowo, 1990). Lepidoptera yang mempunyai pH tetap di bawah 9, dan tidak terdapat penghambat pada saluran pencernaanya, spora berkecambah dan memperbanyak diri dengan kecepatan yang berbeda tergantung spesies inang (Heimpel &
Harshbarger dalam Prabowo, 1990). Dalam kondisi tertentu, B.
thuringiensis mampu membentuk kristal. Kristal tersebut
merupakan kompleks protein yang mengandung toksin dan dikenal dengan nama δ-endotoksin (Heimpel, 1971 dalam Prabowo, 1990).
Kristal protein tersusun dari subunit protein, berbentuk batang atau halter, berukuran sekitar 4,7-11,8 mm dan mempunyai berat molekul sekitar 200.000 (Gambar 3.7). Subunit kristal ini dibangun dari rantai polipeptida yang dihubungkan dengan ikatan kovalen oleh disulda (Cookey, 1971 dalam Prabowo, 1990).
Gambar 3.7.
Kristal protein B. thuringiensis (kiri). Struktur gen Cry2Aa (kanan):
Bt-Toxin Cry2Aa, domain alfa heliks (biru), domain II (hijau), domain III (merah). Gambar diambil dari Protein Database. Public Domain PDB ID: 1I5P (Morse et al., 2001).
Menurut laporan WHO pada tahun 1999, sebanyak 13.000 ton produk B. thuringiensis diproduksi setiap tahunnya melalui teknologi fermentasi aerobik. Sebagian besar produk tersebut mengandung ICP dan spora hidup, sedangkan sebagian lainnya mengandung spora yang telah diinaktivasi. Produk B. thuringiensis konvensional hanya dibuat untuk mengatasi hama lepidoptera yang menyerang tanaman
102
Aplikasi produk B. thuringiensis dapat menyebabkan pekerja lapangan terpapar secara aerosol ataupun melalui kontak dermal, serta mengkontaminasi makanan dan minuman pada lahan pertanian.
Namun hingga tahun 1999, belum ada laporan yang menunjukkan efek parah dari kontaminasi B. thuringiensis pada manusia, kecuali terjadinya iritasi mata dan kulit. Namun, sel vegetatif B. thuringiensis berpotensi memproduksi racun yang mirip dengan yang dihasilkan oleh Bacillus cereus dan belum diketahui apakah dapat menyebabkan penyakit manusia atau tidak. Penggunaan produk B. thuringiensis juga diketahui menimbulkan resitensi pada sebagian insekta, seperti Plodia interpunctella, Cadra cautella, Leptinotarsa decemlineata, Chrysomela scripta, Spodoptera littoralis, Spodoptera exigua, sehingga penggunaan produk tersebut untuk tujuan pengendalian hama harus lebih diperhatikan (WHO, 1999).
pertanian dan perhutanan. Namun sekarang ini, banyak galur B.
thuringiensis yang diproduksi untuk mengatasi serangga golongan Coleoptera dan Diptera (perantara penyakit yang diakibatkan parasit dan virus). B. thuringiensis komersil juga telah diformulasikan sebagai insektisida untuk dedaunan, tanah, lingkungan perairan, dan fasilitas penyimpanan makanan. Contoh penggunaan B. thuringiensis pada lingkungan perairan adalah mengontrol nyamuk, lalat, dan larva serangga pengganggu lain pada waduk penampung air minum.
Setelah diaplikasikan ke suatu ekosistem tertentu, sel vegetatif dan spora akan bertahan pada lingkungan sebagai komponen alami mikroora dalam hitungan minggu, bulan, atau tahunan perlahan-lahan populasi serangga akan berkurang jumlahnya. Namun, ICP secara biologis akan inaktif dalam hitungan jam atau hari (WHO, 1999).
Gen Bentuk
Kristal Bobot
Protein (kDa) Insekta yang dipengaruhi cry I [several subgrup:A(a), A(b),
A(c), B, C, D, E, F, G] bipiramida 130-138 larva Lepidoptera cry II [subgrup A, B, C] kuboid 69-71 Lepidoptera dan
Diptera cry III [subgrup A, B, C] datar/tidak
teratur 73-74 Coleoptera
cry IV [subgrup A, B, C, D] bipiramida 73-134 Diptera
cry V-IX berbagai
macam 35-129 berbagai macam
Tabel 3.4. Klasikasi toksin Bt pada tahun 1995 (Deacon, 1998)
Menurut penelitian Wainhouse (2005), protein atau toksin Cry tersebut akan dilepas bersamaan dengan spora ketika terjadi lisis dinding sel. Ketika termakan oleh larva insekta, maka larva akan menjadi inaktif, makan terhenti, muntah, atau kotorannya menjadi berair. Bagian kepala serangga akan tampak terlalu besar dibandingkan ukuran tubuhnya. Selanjutnya, larva menjadi lembek dan mati dalam hitungan hari atau satu minggu. Bakteri tersebut akan menyebabkan isi tubuh insekta menjadi berwarna hitam kecoklatan, merah, atau kuning, ketika membusuk (Hoffmann & Frodsham, 1993).
Toksin Cry sebenarnya merupakan protoksin, yang harus diaktifkan terlebih dahulu sebelum memberikan efek negatif.
Aktivasi toksin Cry dilakukan oleh protease usus sehingga terbentuk toksin aktif dengan bobot 60 kDa yang disebut delta-endotoksin.
Delta-endotoksin ini diketahui terdiri dari tiga domain. Toksin tersebut tidak larut pada kondisi normal sehingga tidak membahayakan manusia, hewan tingkat tinggi, dan sebagian insekta.
Namun pada kondisi pH tinggi (basa) seperti yang ditemui di dalam usus Lepidoptera, yaitu di atas 9,5, toksin tersebut akan aktif (Deacon, 1998). Selanjutnya, toksin Cry akan menyebabkan lisis (pemecahan) usus lepidoptera (Wainhouse, 2005)
B. thuringiensis dapat memproduksi dua jenis toksin, yaitu toksin kristal (Crystal, Cry) dan toksin sitolitik (cytolytic, Cyt).
Toksin Cyt dapat memperkuat toksin Cry sehingga banyak digunakan untuk meningkatkan efektivitas dalam mengontrol insekta. Lebih dari 50 gen penyandi toksin Cry telah disekuens dan digunakan sebagai dasar untuk pengelompokan gen berdasarkan kesamaan sekuens penyusunnya. Tabel di bawah ini merupakan klasikasi toksin Bt pada tahun 1995 (Deacon,1998).
Menurut Burgenjon & Martouret (1971) dalam Sastrosiswojo (1997), toksisitas B. thuringiensis terhadap serangga tergantung pada galur bakteri dan spesies serangga yang terinfeksi. Faktor yang ada pada bakteri yang mempengaruhi toksisitas adalah jenis kristal proteinnya, sedangkan pada serangga adalah perbedaan keadaan dalam saluran pencernaan larva, seperti pH dalam saluran pencernaan bagian tengah yang dapat mempengaruhi kelarutan kristal protein.
Faktor lainnya adalah kemampuan enzim protease yang ada pada saluran makanan serangga untuk mencerna kristal protein menjadi molekul toksik dan adanya reseptor khusus yaitu aminopeptidase-N dalam saluran pencernaan serangga yang mengikat toksin (Burgenjon
& Morturet, 1991 dalam Sastrosiswojo, 1997). Kristal protein saluran yang termakan oleh larva serangga akan dipecah oleh enzim protease di dalam saluran pencernaan bagian tengah menjadi molekul yang toksik (Hoe & Whiteley, 1989 dalam Prabowo, 1990). Toksin tersebut akan mempengaruhi permeabilitras sel, mikroli pada
104
sel-sel epithelium menyebabkan paralisis saluran makanan dan berubahnya keseimbangan pH hemolimfa, akhirnya menyebabkan kematian (Dubois & Lewis, 1981, Aronson, Beckman & Dunn, 1986 dalam Prabowo, 1990).
Heimpel (1967) dalam Prabowo (1990) berpendapat bahwa B.
thuringiensis toksik terhadap 137 spesies serangga yang meliputi ordo Diptera, Lepidoptera, Hymenoptera, Orthoptera, dan Coleoptera. Kebanyakan larva Lepidoptera mempunyai pH saluran pencernaan bagian tengah sekitar 9,0 dan dengan aktivitas toksin selama 24 jam, pH-nya turun menjadi ± 6,62 (Heimpel, 1967 dalam Prabowo, 1990). Penurun pH antara 1,0 sampai 1,5 dapat menyebabkan kerusakan sel-sel membran epitelium saluran pencernaan.
Gejala serangan B. thuringiensis pada larva Lepidoptera ditandai dengan kehilangan selera makan dan berkurangnya mobilitas larva dengan cepat beberapa jam setelah aplikasi. Larva kurang tanggap terhadap sentuhan. Setelah larva mati, larva makin kelihatan mengkerut dan perubahan warnapun menjadi jelas terlihat.
Tubuh serangga yang mati menjadi lunak dan mengandung cairan kemudian akhirnya membusuk (Sandoz, 1974 dalam Prabowo, 1990).
Keadaan sakit pada larva Lepidoptera karena infeksi B.
thuringiensis disebabkan oleh infeksi endospora dan infeksi racun δ-endotoksin. Pupa dan imago mungkin terbentuk meskipun terinfeksi B. thuringiensis, tetapi umumnya pupa atau imago itu berukuran kecil, cacat atau mandul (Sandoz, 1974 dalam Prabowo, 1990).