Radikal Bebas dan Antioksidan
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat
Penelitian ini mempergunakan 5 ekor monyet ekor panjang (MEP) jantan berumur 3 tahun, bobot badan ±7 kg. Total LDL diisolasi dari plasma darah MEP, makrofag diisolasi dari 20 ekor mencit jantan dan 5 ekor beruk jantan. Seluruh perlakuan yang melibatkan hewan percobaan, dilakukan berdasarkan peraturan yang telah ditentukan dan disetujui Komisi Kesejahteraan Hewan Laboratorium PSSP IPB (ACUC) dengan no: 05-006-IR.
Bahan kimia yang digunakan antara lain DMEM (Gibco, Cat. no. 12100-046), medium RPMI-1640 (Sigma), Pheripheral Blood Mononuclear Cells
(PBMC, Ficoll-Paque Plus Amersham, Biociences), Phosphate Buffer Saline
(PBS), Fetal Bovine Serum (FBS, Sigma), Asam Thiobarbiturat (Sigma), Bovine Serum Albumine (BSA, Sigma), antibiotik (penisilin, streptomisin), asam tiobarbiturat (TBA, Sigma), kupri sulfat (CuSO4.5H2O), kalium tartat, natrium
63 hidroksi, asam trikloro asetat (TCA, merck), natrium klorida, benzidin HCl dan asam 1,1,3,3-tetra metoksi propan (TMP, Sigma).
Alat yang dipergunakan antara lain sentrifugasi berkecepatan rendah Beckman dengan rotor swing Bucket 3750 rpm, ultrasentrifugasi Beckman XL-90 dengan rotor swing-40, tabung polialomer, spektrofotometer UV-Vis DMS 100 (varian), vortex, filter Millipore 0,45, waterbath, hemositometer, mikroskop, cawan kultur sel, flask kultur, pipet mikro dan alat gelas lainnnya.
Metode Penelitian
Pengaruh Konsentrasi Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga Terhadap Tingkat Oksidasi LDL.
Sebanyak 200 µg/ml LDL dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid 2 ppm, 6 ppm dan 8 ppm/ml dalam medium pertumbuhan yang mengandung 10% FBS (v/v) pada suhu 370C selama 48 jam. Untuk kontrol, LDL hanya diinkubasi dengan 0,05% etanol tanpa diberi kurkuminoid ekstrak. Kemudian kultur dicuci dengan PBS sebanyak 3x. Masing-masing perlakuan kemudian ditambahkan Cu2+ 5μM/ml, lalu diinkubasi pada 370C dalam inkubator CO2 dengan waktu inkubasi 4 jam dan 6 jam. Jumlah LDL yang teroksidasi diukur dengan uji TBAR.
Pengaruh Konsentrasi Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga Terhadap Reaksi Oksidasi Lipid dalam Makrofag yang diinduksi dengan Cu2+
Kultur makrofag dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid ekstrak sebanyak 2 ppm, 6 ppm dan 8 ppm/ml, dalam medium pertumbuhan yang mengandung 10% FBS (v/v) pada suhu 370C selama 48 jam. Untuk kontrol sel hanya diinkubasi dengan 0,05% etanol tanpa diberi kurkuminoid ekstrak. Lalu masing-masing kultur perlakuan ditambahkan Cu2+ 5μM/ml, kemudian diinkubasi dengan kelembaban (5% CO2, 95% udara) 370C selama 4 jam dan 6 jam. Banyaknya sel teroksidasi diukur dengan uji TBAR.
64 Pengaruh Pemberian Kurkuminoid Ekstrak Temu Mangga Terhadap Proses LDL Teroksidasi oleh Sel Makrofag
Kultur makrofag dipra-inkubasikan dengan kurkuminoid ekstrak sebanyak 2 ppm, 6 ppm dan 8 ppm/ml, dalam medium pertumbuhan yang mengandung 10% FBS (v/v) pada suhu 370C selama 48 jam. Untuk kontrol sel hanya diinkubasi dengan 0,05% etanol tanpa diberi kurkuminoid ekstrak. Lalu masing-masing kultur perlakuan ditambahkan LDL 200 µg/ml dan Cu2+ 5 μM/ml, kemudian diinkubasi dengan kelembaban (5% CO2, 95% udara) 370C selama 4 jam dan 6 jam. Jumlah LDL yang teroksidasi diukur dengan uji TBAR.
Prosedur Penelitian
Pengambilan Plasma Darah.
Senyawa LDL plasma diisolasi dari darah MEP yang diberi pakan aterogenik selama 3 bulan, dan sebelumnya telah diadaptasikan selama 2 minggu (Adams et al. 1985). Sebelum pengambilan darah, MEP dipuasakan selama 24 jam. Pada saat pengambilan darah, MEP dibius menggunakan ketamin 10 mg/10 kg bobot badan, darah diambil melalui vena femoralis. Darah tersebut dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi EDTA 1 mg/ml dan dijaga pada suhu 40C, lalu darah disentrifus untuk mendapatkan plasma darah.
Isolasi Lipoprotein Densitas Rendah (LDL).
Lipoprotein densitas rendah diisolasi sesuai dengan metode yang dilakukan oleh Sulistiyani dan Clair (1991). Plasma darah dipisahkan dengan cara sentrifugasi selama 30 menit menggunakan Beckman GS-6R ‘low speed centrifuge’ dengan kecepatan 2700 rpm pada suhu 40C.
Sebanyak 8 ml, plasma darah dimasukan ke dalam tabung polialimer dan ditambahkan 5 ml larutan 0,9% NaCl- 0,01 % EDTA (w/v) secara hati-hati hingga tabung penuh. Larutan NaCl-EDTA ini berfungsi sebagai gradien densitas. Selanjutnya, plasma darah disentrifus dengan menggunakan ultrasentrifus Beckman XL-90 dengan rotor SW 40 pada suhu 4oC selama 20 jam dengan kecepatan 36000 rpm, dari pemusingan diperoleh β-Very Low Density Lipoprotein (β-VLDL) yang terpisah, dengan cara mengambil lapisan bagian
65 bawah (d>1,006 g/ml) adalah plasma dan lapisan atas (d<1,006 g/ml). Lapisan bawah ini kemudian ditambahkan Kalium Bromida (KBr) sebanyak 0,1109 g/ml, kemudian dicampur hingga larut dan merata. Campuran larutan tersebut diambil 9 ml dan dipindah ke dalam tabung sentrifus polialomer yang baru dan ditambahkan 4 ml KBr (d=1,063 g/ml) yang mengandung larutan 0,9% NaCl-0,01% EDTA, lalu disentrifus dengan menggunakan ultrasentrifugasi dengan rotor SW-40 pada kecepatan 36000 rpm pada suhu 40C selama 24 jam, dari pemusingan akan diperoleh LDL pada lapisan atas dan dipisahkan dengan menggunakan alat pemotong tabung. Fraksi LDL yang diperoleh, dilakukan dialisis dengan larutan 0,9% NaCl-0,01% EDTA pH 7,4/40C, dilakukan 3X2 L selama 72 jam. Fraksi LDL yang diperoleh selanjutnya, disaring dengan milipore 0,45 µ m dan disimpan pada suhu 40C. Pengujian terhadap kandungan protein dilakukan dengan uji Lowry dengan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar (Lowry 1951).
Sediaan LDL yang telah diukur proteinnya dilakukan dialisis kembali menggunakan larutan 0,9% NaCl-0,01% EDTA pH 7,4/40C, dilakukan 3 x 2 L selama 72 jam. Dialisis ini bertujuan untuk menghilangkan EDTA dari sediaan LDL. Fraksi LDL yang diperoleh akan digunakan untuk penelitian berikutnya. Adapun derajat oksidasi LDL yang terbentuk diukur dengan uji asam tiobarbiturat (Kleinveld et al. 1992; Conti et al. 1991).
Isolasi Makrofag Mencit.
Mencit percobaan diinjeksi secara peritoneal dengan 2,5 ml tioglikolat (24 g/L dalam larutan saline). Setelah 4 hari sel dipanen, lalu dicuci dan disentrifus 3 kali dengan PBS pada 1500 rpm selama 10 menit pada suhu 250C. Sel tersebut kemudian diresuspensikan kembali dan dikonsentrasikan 1 x 109/L dengan DMEM yang mengandung 10 % FBS, 100000 U penisilin/L, 100 mg streptomisin dan 2 mmol glutamin/l. Suspensi sel ditumbuhkan dalam petridish 35 mm dan diinkubasi dalam inkubator dengan kelembaban tertentu (5% CO2, 95% udara) selama 4 jam. Setelah itu, sel dicuci dengan 5 ml DMEM untuk membuang sel yang tidak menempel pada dasar kultur, sedangkan sel monolayer diinkubasi kembali selama 18-24 jam sampai makrofag siap digunakan (Aviram et al. 2000).
66 Isolasi Makrofag Beruk.
Darah diambil dari vena femoralis setelah beruk telah dibius dengan ketamin (10mg/kg boboit badan). Darah-EDTA yang diperoleh selanjutnya disentrifugasi selama 15 menit dengan menggunakan Beckman GS-6R ‘low speed centrifuge’ dengan kecepatan 1500 rpm pada suhu 40C. Buffy coat yang diperoleh lalu dipisahkan dan ditampung dalam tabung yang telah berisi PBS dan dicampur dengan perbandingan 1:1. Campuran tersebut kemudian dilapisi dengan
Lymphocyte Separation Medium (LSM) yang mengandung 6,2 g ficoll dan 9,49 g sodium diatrizole, lalu disentrifus kembali selama 30 menit pada 1500 rpm pada suhu 40C. Peripheral Blood MononuclearCells (PBMC) dipanen dan dipindahkan ke dalam tabung yang telah berisi PBS lalu disentrifus kembali pada kecepatan 1500 rpm selama 15 menit pada 40C. Pelet yang diperoleh dipisahkan dan dimasukkan ke tabung yang telah berisi RPMI (Gibco, Invitrogen Corp) lalu diresuspensikan untuk dihitung. Jumlah sel dihitung dengan menggunakan 2% asam asetat dengan alat counting chamber. Setelah dihitung, sel dikultur dalam
petridish yang berisi RPMI mengandung 10% FBS (Gibco, Invitrogen Corp), 100000 U penisilin/L, 100 mg streptomisin dan 2 mmol glutamin/L. Suspensi sel ditumbuhkan pada petridish 35 mm dan diinkubasi dalam inkubator dengan kelembaban (5% CO2, 95% udara) 370C selama 4 jam. Sel dicuci dengan 5 ml RPMI untuk membuang sel yang tidak menempel pada kultur flask, sedangkan sel monolayer diinkubasi kembali dengan RPMI selama 18-24 jam sampai makrofag konfluen, kemudian medium diganti dan makrofag siap digunakan.
Pengujian Sampel untuk Uji Asam Tiobarbiturat (TBARS)
Pembuatan Kurva Standar. Standar yang digunakan untuk mengukur asam tiobarbiturat adalah 1,1,3,3 tetra metoksi propan (TMP). Larutan stock pereaksi 1,1,3,3 tetra metoksi propan 600 mM, dibuat menjadi 0,5; 0,8; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 dan 10 μM . Masing-masing konsentrasi diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Setiap tabung reaksi ditambahkan 1,0 ml TCA 20% dan 1,0 ml TBA 1% dalam pelarut asam asetat 20%. Seluruh tabung kemudian diinkubasi selama 45 menit pada suhu 950C. Setelah diinkubasi, semua tabung didinginkan lalu disentrifus selama15 menit pada 1000 rpm, absorban
67 diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang ( ) 532 nm.
Pengujian Sampel. Jumlah LDL yang teroksidasi dari masing-masing sampel, dilakukan proses yang sama seperti standar, yaitu 0,1 ml sampel +1,0 ml TCA 20%+1,0 ml TBA 1% dalam asam asetat 20%. Selanjutnya, diinkubasi selama 45 menit pada suhu 950C, dibiarkan dingin lalu disentrifus pada 1000 rpm selama 15 menit dengan menggunakan Beckman GS-BR low speed centrifuge, kemudian diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang ( ) 532 nm.
Peubah yang Diamati
Dalam penelitian ini, peubah yang diamati antara lain jumlah total protein LDL plasma, konsentrasi Malonaldehida (MDA) dan jumlah hambatan oksidasi LDL.
Analisis Data
Kolesterol total ditentukan dengan kit kolesterol. Data hasil penelitian disajikan dalam bentuk tabel rerata oksidasi LDL, yaitu MDA dan dilanjutkan uji ragam (ANOVA) dengan menggunakan prosedur General Linear Model (GLM) disain faktor tersarang (nested) menggunakan program Minitab 14.13. Perlakuan yang bermakna akan dilanjutkan dengan uji pembanding rataan nilai tengah Tukey.Uji rerata nilai tengah Tukey ini bertujuan untuk mendapatkan rataan nilai tengah yang bermakna dari penelitian ini yang berbeda (Gaspersz 1991).
HASIL DAN PEMBAHASAN