Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Bioteknologi Hutan Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB, dan kebun Percobaan Cikabayan IPB. Penelitian ini dilaksanakan selama 4 bulan, dari bulan Januari sampai April 2005.
Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari benih A. mangium, patogen, cendawan antagonis, dan minyak sereh. Benih A. mangium
yang diuji berasal dari KPH Cianjur. Patogen penyebab penyakit lodoh diisolasi dari benih A. mangium sedangkan cendawan antagonis diisolasi dari tanah tegakan
A. mangium. Minyak sereh yang diuji diperoleh dari pasar dan diproduksi oleh Nuansa Kimia Farma Jakarta.
Metode Penelitian
Penelitian ini diawali dengan uji pendahuluan yang bertujuan untuk: (1) mendapatkan cendawan patogen penyebab penyakit lodoh, (2) mengisolasi cendawan antagonis Trichoderma sp., (3) menguji kemampuan antagonisme dari
Trichoderma sp. terhadap cendawan patogen secara in vitro, (4) menguji pengaruh minyak sereh terhadap pertumbuhan cendawan patogen secara in vitro, dan (5) menentukan konsentrasi minyak sereh yang akan digunakan dalam pelapisan benih.
Apabila dari uji pendahuluan yang dilakukan secara in vitro diperoleh hasil minyak sereh dan Trichoderma sp. mampu menekan pertumbuhan cendawan patogen, maka dilakukan pengujian pada semai (in vivo). Secara skematis, seluruh rangkaian percobaan, baik in vitro maupun in vivo mengikuti langkah-langkah sebagaiman tersaji pada Gambar 1.
Isolasi Cendawan Patogen Lodoh
Isolasi cendawan patogen penyebab penyakit lodoh dari benih A. mangium
14
Gambar 1.Tahapan Kegiatan Penelitian Pemanfaatan Minyak Sereh dan
Trichoderma sp. untuk Mengendalikan Patogen terbawa Benih Acacia mangium Willd. Isolasi Cendawan Antagonis Biakan Murni Uji Patogenisitas pada A. mangium Kandidat Antagonis Kandidat Patogen Isolasi Cendawan Patogen Minyak Sereh Biakan Murni Uji Penghambatan terhadap koloni patogen
Uji Antagonisitas
in vitro
Uji in vivo
Pengendalian F. solani dan peningkatan kualitas semai akasia
15
Metode kesehatan benih yang digunakan adalah metode blotter yang direkomendasikan ISTA (1999). Metode ini didasarkan pada pertumbuhan kecambah dan propagul cendawan. Tahapan kegiatan dalam isolasi cendawan patogen penyebab penyakit lodoh dari benih A. mangium adalah sebagai berikut :
1. Penyiapan media. Tiga helai kertas merang steril dilembabkan dengan cara mencelupkannya ke dalam aquades, kemudian ditempatkan dalam cawan petri.
2. Seleksi benih. Dipilih benih A. mangium yang besar, bernas, dan seragam untuk ditempatkan pada cawan petri yang telah berisi kertas merang. Kegiatan dilakukan secara aseptik di meja laminar.
3. Perlakuan benih. Untuk mendeteksi cendawan yang berada dalam jaringan benih, benih diberi perlakukan desinfektan alkohol 70 % selama 2-5 menit, kemudian dibilas dengan air steril. Sedangkan benih tanpa perlakuan desinfektan digunakan untuk mendeteksi cendawan pada permukaan benih. Masing-masing perlakuan menggunakan 20 benih/cawan petri dengan 10 kali ulangan.
4. Kolonisasi patogen. Benih uji dalam cawan petri diinkubasi selama tujuh hari. Pada hari pertama benih ditempatkan pada suhu ruang selama 24 jam dengan penyinaran NUV 12 jam terang dan 12 jam gelap. Pada 24 jam ke dua benih diinkubasi pada suhu -200C, selanjutnya pada hari ke tiga sampai hari ke tujuh benih diinkubasi pada suhu ruang dengan penyinaran NUV 12 jam terang dan 12 jam gelap secara bergantian.
5. Pemurnian isolat. Patogen yang teridentifikasi sebagai F. solani diambil sporanya menggunakan jarum ose di bawah mikroskop, kemudian dimurnikan pada media PDA dan dipelihara selama lima hari.
Patogen hasil biakan tersebut akan digunakan dalam uji patogenisitas. 6. Pengamatan dan identifikasi isolat. Pada hari ke delapan diamati jenis
patogen yang terbawa benih dengan menggunakan mikroskop, baik pada perlakuan desinfektan maupun tanpa desinfektan. Isolat patogen yang teramati kemudian diidentifikasi menggunakan kunci identifikasi Watanabe (1993).
16
Pengujian Patogenisitas Isolat Patogen Lodoh
Urutan kegiatan dalam pengujian patogenisitas isolat patogen lodoh adalah sebagai berikut :
1. Perbanyakan inokulum cendawan pato gen. Perbanyakan inokulum cendawan patogen dilakukan pada media CMS (Corn Meal Sand) yang berupa campuran pasir, hancuran biji jagung, dan air (96:4:20 g/g/ml). Sebanyak 100 g media tersebut dimasukkan ke dalam labu erlemeyer kemudian disterilkan dalam otoklaf (1210C, 1 atm). Pada masing-masing media yang sudah steril tersebut di atas, ditanam tiga potongan koloni patogen (∅ 6 mm) yang sudah berumur 5 hari dan selanjutnya diinkubasi pada suhu kamar selama 2 minggu
2. Pembuatan media tanam. Media tanam yang digunakan adalah campuran top soil dan pasir (1:1) yang telah disterilkan. Sebanyak 100 g media tanam tersebut dimasukkan ke dalam politube.
3. Infestasi patogen ke dalam media tanam. Setelah masa inkubasi cendawan beserta mediumnnya sebanyak 3.5 g dimasukkan ke dalam media tanam, kemudian ditambahkan 15 ml air steril. Wadah tanam selanjutnya ditutup dengan plastik dan didiamkan selama 4 hari.
4. Penanaman benih A. mangium. Benih A. mangium ditanam pada media tanam tersebut di atas. Untuk kontrol, benih A. mangium ditanam pad a media tanam steril tanpa isolat cendawan.
5. Pemeliharaan. Pemeliharaan dilakukan dengan cara menyiram benih dalam politube pada pagi dan sore hari selama 30 hari.
6. Pengamatan. Pengamatan dilakukan terhadap gejala penyakit lodoh berdasarkan persentase semai mati, pada umur 2 minggu setelah sebar. Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan F. solani
dan tanpa F. solani (kontrol) sebagai perlakuan. Masing-masing perlakuan diulang 4 kali sehingga terdapat 8 satuan percobaan, dan pada setiap satuan percobaan dikecambahkan 10 benih A. mangium.
Data yang diperoleh dianalisis sidik ragam sesuai rancangan yang digunakan menggunakan program Statistical Analysis System (SAS).
17
Isolasi Cendawan Antagonis
Trichoderma sp. diisolasi dari tanah tegakan A. mangium dengan metode pengenceran sebagai berikut :
1. Pembuatan suspensi. Sebanyak 10 g tanah disuspensikan dalam 90 ml air steril.
2. Pengenceran. Pengenceran yang digunakan untuk isolasi cendawan adalah 10-4.
3. Pembiakan cendawan. Seb anyak 0.1 ml suspensi yang telah diencerkan, ditumbuhkan pada medium PDA (Potato Dexrose Agar).
4. Pemurnian isolat. Cendawan antagonis yang teridentifikasi sebagai
Trichoderma sp. diambil sporanya menggunakan jarum ose di bawah mikroskop, kemudian dimurnikan pada media PDA selama lima hari untuk selanjutnya digunakan dalam pengujian antagonisme in vitro.
5. Pengamatan dan Identifikasi isolat. Jenis cendawan antagonis yang tumbuh diamati di bawah mikroskop. Isolat cendawan antagonis yang diperoleh kemudian diidentifikasi menggunakan kunci identifikasi Watanabe (1993).
Pengujian Antagonisme in vitro
Uji antagonisme cendawan antagonis terhadap cendawan patogen dilakukan dengan cara sebagai berikut :
1. Pembiakan isolat cendawan antagonis Trichoderma sp. dan patogen
F. solani. Satu potong isolat Trichoderma sp. dan satu potong isolat patogen F. solani, semuanya dari biakan yang berumur 5 hari, diletakkan dalam satu cawan petri berdiameter 9 cm yang berisi media PDA. Prosedur ini diulang tiga kali sebagai ulangan. P otongan biakan diletakkan berlawanan arah dengan jarak 5 cm dan jarak kedua isolat ke tepi cawan petri mas ing-masing 2 cm. Kemudian, biakan dalam cawan petri tersebut diinkubasi selama 4 hari.
2. Pengamatan. Variabel yang diamati adalah persentasi daya hambat cendawan antagonis Trichoderma sp.terhadap patogen F. solani. Variabel
18
ini diamati pada hari ke-5 setelah penanaman dan dihitung berdasarkan persamaan Fokkema (1973) diacu oleh Skidmore (1976) sebagai berikut : r1 – r2
Persentase penghambatan (%) = x 100% r1
Keterangan:
r1 = jari-jari koloni patogen yang menuju ke ujung cawan petri r2 = jari-jari koloni patogen yang menuju ke koloni Trichoderma sp. Percobaan ini tidak menggunakan rancangan tertentu, sedangkan data yang diperoleh disajikan dalam bentuk rata-rata persentase penghambatan dan gambar (Foto).
Pengujian Daya Hambat Minyak Sereh terhadap Pertumbuhan Koloni Patogen in vitro
Pengujian ini dilakukan dengan tahapan sebagai berikut :
1. Pembuatan konsentrasi minyak sereh. Pembuatan konsentrat minyak sereh dilakukan dengan mencampurkan minyak sereh dengan pengemulsi tween 80 dan air destilata, sehingga membentuk medium dengan konsentrasi minyak sereh tertentu. Untuk konsentrasi minyak sereh 0.1% misalnya, dibuat dengan cara memipet minyak sereh, tween 80, dan air destilata masing-mas ing sebanyak 0.1, 0.5, dan 0.94 µl, kemudian ketiganya dicampur.
2. Aplikasi minyak sereh. Minyak sereh dengan konsentrasi seperti di atas dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambahkan medium PDA. 3. Penanaman Patogen. Potongan biakan murni patogen (umur 7 hari dan
berdiameter 6 mm) yang telah diperoleh berdasarkan uji patogenisitas ditumbuhkan pada cawan petri berisi medium campuran PDA dengan minyak sereh dengan konsentrasi seperti di atas. Selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang dan diberi sinar NUV 12 jam terang dan 12 jam gelap secara bergantian selama tujuh hari
4. Pengamatan. Pengamatan dilakukan pada hari ke tujuh. Variabel yang diukur adalah persentase penghambatan yang dihitung dengan rumus :
19
R1 – R2
DH = ________ x 100 % R1
Keterangan : DH = persen daya hambat (%) R1 = diameter koloni kontrol (mm) R2 = diameter koloni perlakuan (mm)
Nilai persentase penghambatan merupakan pengurangan pertumbuhan cendawan yang ditumbuhkan pada media yang ditambahkan dengan minyak sereh dibandingkan dengan pertumbuhan cendawan pada media kontrol.
Percobaan disusun dalam RAL dengan konsentrasi minyak sereh sebagai perlakuan yang terdiri dari empat taraf : 0.0% (tanpa minyak sereh sebagai kontrol), 0.1%, 0.2%, dan 0.4%. Masing-masing perlakuan diulang lima kali. Setiap ulangan berupa satu biakan dalam satu cawan petri.
Data yang diperoleh dianalisis ragam sesuai rancangan yang digunakan menggunakan program SAS. Apabila pengaruh perlakuan bersifat nyata, analisis dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan pada taraf nyata 5 % untuk mengetahui perbedaan nilai tengah perlakuan.
Pengujian in vivo
Uji in vivo dilakukan untuk mengetahui efektivitas minyak sereh dan cendawan antagonis Trichoderma sp. dalam mengendalikan patogen F. solani
penyebab penyakit lodoh dan meningkatkan kualitas benih A. mangium. Bahan-bahan yang digunakan meliputi : minyak sereh, filtrat cendawan antagonis
Trichoderma sp., koloni patogen F. solani, benih A. mangium, dan media tanam. Urutan kegiatan dalam percobaan ini adalah sebagai berikut :
1. Pembuatan filtrat Trichoderma sp. Tiga potongan koloni berdiameter 6 mm dari cendawan antagonis diambil dari biakan murni berumur 5 hari kemudian ditanam dalam labu erlemeyer yang berisi 100 ml medium kentang dekstrosa cair. Biakan dalam labu erlemeyer tersebut diinkubasi selama 15 hari, kemudian dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring, untuk memperoleh filtrat biakannya.
20
2. Pembuatan media tanam. Media tanam yang digunakan berupa campuran top soil dan pasir (1:1) yang telah disterilkan. Sebanyak 100 g media tersebut dimasukkan ke dalam politube.
3. Perbanyakan inokulum cendawan patogen. Perbanyakan inokulum cendawan patogen dilakukan pada media CMS yang berupa campuran pasir, hancuran biji jagung, dan air (96:4:20 g/g/ml). Sebanyak 100 g media tersebut dimasukkan ke dalam labu erlemeyer kemudian disterilkan dalam otoklaf (1210C, 1 atm). Pada masing-masing media yang sudah steril tersebut di atas, ditanam tiga potongan koloni patogen (∅ 6 mm) yang sudah berumur 5 hari dan selanjutnya diinkubasi pada suhu kamar selama 2 minggu.
4. Infestasi patogen dalam media tanam. Patogen F. solani yang digunakan diperoleh dari hasil isolasi dan pemurnian serta telah diuji patogenisitasnya sebagaimana telah dijelaskan pada percobaan sebelumnya. Pada masing-masing media tanam, diinfestasikan sebanyak 3.5 g inokulum F. solani beserta mediumnya, kemudian ditambahkan 15 ml air steril. Selanjutnya media tanam ditutup dengan plastik dan didiamkan selama 4 hari.
5. Pelapisan benih dengan filtrat Trichoderma sp. Filtrat biakan dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian benih A. mangium direndam dalam filtrat tersebut selama 1 jam.
6. Pelapisan benih dengan minyak sereh. Minyak sereh dengan konsentrasi sesuai perlakuan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian benih A. mangium direndam dalam minyak sereh tersebut selama 1 jam
7. Penanaman benih dalam politube. Setelah benih direndam dalam filtrat
Trichoderma sp. dan minyak sereh kemudian benih dicuci dengan air steril, selanjutnya ditanam dalam politube.
8. Pemeliharaan. Pemeliharaan dilakukan dengan cara menyiram benih dalam politube pada pagi dan sore hari selama 30 hari.
9. Pengamatan. Variabel yang diamati meliputi persentase semai mati, panjang batang serta kadar peroksidase semai A. mangium. Pengamatan
21
terhadap persentase semai mati dilakukan pada umur 2 minggu, panjang batang pada umur 3 minggu, sedangkan kadar peroksidase pada umur 4 minggu setelah sebar.
a). Persentase serangan. Persentase serangan ditentukan dengan cara menghitung jumlah benih terserang patogen dibagi total benih yang dikecambahkan kemudian dikali 100%.
b). Panjang batang (cm). Panjang batang diukur dari pangkal sampai ujung batang (pucuk).
c). Aktivitas peroksidase. Penentuan aktivitas peroksidase mengikuti prosedur Cohen dikemukakan oleh Simons dan Ross (1970) dan telah dimodifikasi seperti disajikan pada Lampiran 1.
Percobaan menggunakan RAL dengan pelapisan benih sebagai perlakuan yang terdiri dari tiga taraf : tanpa pelapisan benih (A) sebagai kontrol, pelapisan benih dengan minyak sereh 0.1 % (B), dan pelapisan benih dengan filtrat biakan
Trichoderma sp. (C). Setiap perlakuan diulang empat kali sehingga terdapat 12 satuan percobaan. Masing-masing ulangan menggunakan 10 benih yang masing-masing ditanam dalam tabung politube terpisah
Data yang diperoleh dianalisis ragam sesuai rancangan yang digunakan menggunakan program SAS. Apabila pengaruh perlakuan bersifat nyata, analisis dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan pada taraf nyata 5 % untuk mengetahui perbedaan nilai tengah perlakuan.