Penelitian dilaksanakan mulai Oktober 2014 hingga Maret 2016. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini yaitu D. dadantii, C. violaceum, Escherichia coli DH5α, E. coli BL21 (DE3) dan 31 isolat bakteri Gram positif koleksi Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor, Indonesia (Lampiran 1). Plasmid yang digunakan yaitu plasmid pTZ57R/T (InsTAclone Thermo Scientific), plasmid pET-28a (Novagen), enzim restriksi BamHI dan SalI (Thermo Scientific), HiYield Gel/PCR fragment extraction kit (Real Biotech corp.). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen laktonase yaitu primer forward aiiA1 5'-ATG ACA GTA AAR AAR CTT TAT TTC-3' dan primer reverse aiiA2 5'-TCA CTA TAT ATA YTC MGG GAA CTC- 3 (Pan et al. 2008). Primer yang telah ditambah dengan enzim restriksi yaitu aiiA-
F1 5’-CGC GGA TCC ATG ACA GTA AAR AAR CTT TAT TTC-3 (nukleotida yang digarisbawahi merupakan situs restriksi enzim BamHI) dan aiiA-R1, 5-AGC GGT CGA CTC ACT ATA TAT AYT CMG GGA ACT C-3 (nukleotida yang digarisbawahi merupakan situs restriksi enzim SalI). PCR koloni untuk memperoleh sekuen gen aiiA lengkap digunakan primer forward M13 5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’ dan primer reverse M13 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’. Identifikasi bakteri berdasarkan gen 16S rRNA. Amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan dua primer yaitu primer forward 27F 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′ dan primer reverse 14λ2R 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’ (Jiang et al. 2006).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu mesin PCR Thermocycle (Applied Biosystem), spektrofotometer Spectronic 20D+ (Thermo Spectronic), mesin sentrifugasi Micro 200R (Hettich Zentrifugen), mesin gel electrophoresis (MyRun.NC), SDS-PAGE Electrophoresis (Biorad), dan UV-transilluminator (Ultra.Lum).
Penapisan Bakteri Penghasil AHL-laktonase
Bio-assay aktivitas anti-QS terhadap C. violaceum
Pengujian ini dilakukan untuk melihat penghambatan ekspresi violacein dari bakteri C. violaceum yang diinduksi oleh AHL. Pengujian dilakukan dengan metode disc diffusion assay dengan teknik double layer culture plate sesuai Song et al. (2012) dengan modifikasi. Media LB agar (1.5%) dituang pada cawan petri steril dan didiamkan hingga mengeras, kemudian diatasnya dituang media LB agar (0.5%) yang telah diinokulasi dengan C. violaceum 1% (v/v). Selanjutnya kertas saring steril (diameter 6 mm) direndam dalam supernatan bakteri uji selama
20 detik kemudian diletakkan di permukaan agar. Supernatan bakteri uji diperoleh dengan cara disentrifugasi 1.5 ml biakan bakteri pada kecepatan 12 000 rpm selama 10 menit dan disaring menggunakan milipore 0.2 µm (Minisart, Sartorius Stediem Biotech, Germany). Selanjutnya perlakuan diinkubasi pada suhu ruang selama semalam. Penghambatan QS ditandai dengan adanya zona penghambatan produksi violacein disekitar kertas saring. Zona penghambatan produksi violacein ditunjukkan dengan tidak adanya warna ungu. Penghambatan QS terhadap C. violaceum diukur berdasarkan diameter zona penghambatan produksi violacein yang terbentuk.
Bio-assay aktivitas antibiosis terhadap C. violaceum
Pengujian antibiosis bertujuan untuk memastikan bahwa zona penghambatan produksi violacein yang terbentuk pada pengujian anti-QS terhadap C. violaceum merupakan penghambatan QS, maka dilakukan pengujian aktivitas anti-mikroba (antibiosis) mengikuti metode Song et al. (2012). Sebanyak 6 mL LB diinokulasi dengan C. violaceum OD600=0.05. Sebanyak 50 µL supernatan ditambahkan ke dalam tabung yang berisi C. violaceum OD600=0.05. Kontrol positif menggunakan antibiotik kanamisin 25 mg mL-1 dan kontrol negatif menggunakan LB steril. Tabung diinkubasi selama 12 jam pada suhu 30 oC. Nilai absorbansi untuk mengetahui pertumbuhan bakteri diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm.
Deteksi gen penyandi AHL-laktonase (gen aiiA)
Deteksi gen penyandi AHL-laktonase diawali dengan ekstraksi DNA total bakteri. Ekstraksi DNA total bakteri menggunakan DNA Extraction kit (Geneaid). Amplifikasi gen laktonase dilakukan menggunakan primer forward aiiA1 dan primer reverse aiiA2. Komposisi PCR per reaksi meliputi: 1 µL Primer aiiA1 20 pmol, 1 µL primer aiiA2 20 pmol, 12.5 µL PCR ready mix (DreamTaq 2X, Thermo Scientific), 9.5 µL air bebas nuklease, dan 1 µL DNA cetakan (template). Kondisi PCR yang digunakan yaitu pre-denaturation pada suhu 94 oC selama 5 menit, denaturation pada suhu 94 oC selama 1 menit, annealing pada suhu 55 oC selama 1.5 menit, extention pada suhu 72 oC selama 2 menit (diulang 30 siklus), dan final extention akhir pada suhu 72 oC selama 5 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% pada tegangan 75 volt selama 45 menit. Visualisasi DNA dilakukan dengan UV transilluminator Sambrook et al. (1989).
Identifikasi Bakteri berdasarkan Analisis Kesejajaran Urutan Nukleotida Gen 16S rRNA
Ekstraksi DNA dan amplifikasi gen 16S rRNA
Ekstraksi DNA total menggunakan GeneJet DNA Extraction kit (Thermo Scientific). Amplifikasi gen 16S rRNA dari genom bakteri menggunakan primer universal dengan teknik PCR. Primer yang digunakan yaitu primer forward 27F dan primer reverse 1492R (Jiang et al. 2006). Komposisi PCR per reaksi meliputi: 1 µL primer 27F 20 pmol, 1 µL primer 1492R 20 pmol, 12.5 µL PCR ready mix (DreamTaq 2X, Thermo Scientific), 9.5 µL air bebas nuklease, dan 1 µL DNA cetakan (template). Kondisi PCR meliputi pre-denaturation pada suhu 94 oC selama 3 menit, denaturation pada suhu 94 oC selama 30 detik, annealing pada suhu 57 oC selama 30 detik, extention pada suhu 72 oC selama 1.5 menit (diulang
30 siklus), dan final extension pada suhu 72 oC selama 10 menit. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% dan diamati dengan UV transilluminator (Sambrook et al. 1989).
Perunutan nuklotida dan analisis kesejajaran gen 16S rRNA
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA tiap isolat yang diperoleh selanjutnya dikirim ke 1st Base Asia untuk perunutan urutan nukleotida. Hasil sekuensing yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan sekuen yang tersedia pada NCBI GenBank Database dengan software Basic Local Allignment Search Tools (BLAST) (Zhang et al. 2000).
Uji Keefektifan Bakteri Penghasil AHL-laktonase dalam Menghambat Virulensi Bakteri D. dadantii
Pengujian pada anggrek
Isolat yang terdeteksi menghasilkan AHL-laktonase selanjutnya diuji kemampuannya dalam menekan virulensi D. dadantii. Pengujian penekanan virulensi D. dadantii dilakukan pada anggrek (Phalaenopsis sp. Hibrida MP-152). Supernatan isolat uji ditambah dengan 0.1X volume D. dadantii OD600=0.5. Sebanyak 25 µL dari campuran tersebut disuntikkan pada bagian bawah daun anggrek. Perlakuan kontrol menggunakan supernatan E. coli DH5α. Tanaman anggrek yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter busuk lunak yang terbentuk.
Pengujian pada potongan kentang
Pengujian aktivitas AHL-laktonase terhadap D. dadantii juga dilakukan pada kentang menggunakan metode Dong et al. (2004) yang telah dimodifikasi. Kentang disterilisasi permukaan menggunakan etanol 70% selama 1 menit dan dibilas dengan air steril. Kentang dipotong dan dilukai 6 mm pada bagian tengah. Supernatan isolat uji ditambahkan 0.1X volume D. dadantii OD600=0.5. Potongan kentang selanjutnya ditetesi dengan 20 µL campuran suspensi D. dadantii dan supernatan isolat uji. Perlakuan kontrol menggunakan supernatan E. coli DH5α. Semua potongan kentang kemudian diinkubasi pada suhu 28 oC selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter busuk lunak.
Rancangan percobaan dan analisis statistik
Rancangan percobaan yang digunakan dalam pengujian penghambatan gejala busuk lunak pada kentang dan anggrek adalah rancangan acak lengkap (RAL). Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) menggunakan program Microsoft Office Excel 2010 dan SPSS Statistics versi 17.0. Pengaruh perlakuan yang berbeda nyata dilakukan uji lanjut dengan uji selang berganda Duncan (DMRT) pada taraf nyata 5%. Nilai tingkat penghambatan relatif (THR) perkembangan busuk lunak dihitung dengan rumus: (Diameter busuk pada kontrol) – (Diameter busuk pada perlakuan) THR = x 100% (Diameter busuk pada kontrol)
Kloning dan Analisis Sekuen Gen aiiA Penyandi AHL-laktonase Kloning gen aiiA pada plasmid pTZ57R/T
Analisis gen aiiA dilakukan dengan kloning gen aiiA pada plasmid pTZ57R/T dengan metode TA-kloning menggunakan insTAclone PCR cloning kit (Thermo Scientific). Fragmen gen aiiA diligasi dengan plasmid pTZ57R/T. Komposisi ligasi meliputi 1 µL vektor pTZ57R/T, 1 µL DNA sisipan, 1 µL 10X buffer ligasi, 0.34 µL T4 DNA ligase, dan 6.66 µL air bebas nuclease. Ligasi dilakukan pada suhu 4 oC selama semalam. Hasil ligasi antara plasmid pTZ57R/T dengan fragmen gen aiiA selanjutnya disebut pTZ57R/T::aiiA. Hasil ligasi tersebut ditransformasi pada E. coli DH5α. Seleksi hasil transformasi dilakukan dengan seleksi biru-putih pada media LB agar yang telah ditambah dengan ampisilin 50 µg mL-1, IPTG, dan X-gal. Selanjutnya dilakukan PCR koloni menggunakan primer M13 forward dan M13 reverse untuk mengkonfirmasi DNA sisipan. Hasil amplifikasi gen aiiA yang diperoleh selanjutnya dikirim ke 1st Base Asia untuk perunutan nukleotida.
Analisis sekuen gen aiiA dan asam amino AiiA
Hasil perunutan nukleotida dibandingkan dengan sekuen yang tersedia pada data NCBI GenBank Database dengan perangkat lunak Basic Local Allignment Search Tools (BLAST) (Zhang et al. 2000). Analisis daerah terkonservasi asam amino dari gen aiiA yang diperoleh dilakukan dengan perangkat lunak MEGA versi 6.0. Deteksi signal peptide dianalisis dengan perangkat lunak signalP. Konstruksi struktur protein tiga dimensi enzim AHL-laktonase dilakukan dengan menggunakan software Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org/). Pendugaan ukuran bobot molekul protein dan nilai pI dari asam amino AHL-laktonase dari sekuen gen aiiA dihitung menggunakan perangkat lunak ExPaSy (http://web.expasy.org/compute_pi/). Simulasi translasi ekspresi gen aiiA pada plasmid pET-28a dilakukan dengan perangkat lunak ExPaSy translate tool (http://web.expasy.org/translate/) (Sakr et al. 2013).
Sub-kloning dan Ekspresi Gen aiiA pada E. coli BL21 (DE3) Penyiapan fragmen Gen aiiA
Penyiapan fragmen gen aiiA diawali dengan isolasi plasmid pTZ57R/T::aiiA. Fragmen gen aiiA diambil dengan cara memotong plamid pTZ57R/T yang diperoleh dengan metode double digest menggunakan enzim BamHI dan SalI sesuai protokol (Thermo Scientific). Hasil restriksi kemudian dielektroforesis selanjutnya fragmen gen laktonase yang terlihat dipurifikasi dengan HiYield Gel/PCR Fragmen Extraction Kit (gel extraction protocol). Hasil purifikasi gen fragmen gen laktonase siap digunakan untuk ligasi.
Penyiapan plasmid ekspresi pET-28a
E. coli DH5α yang mengandung plasmid pET-28a ditumbuhkan pada media LB agar yang mengandung kanamisin 25 µg/mL dan diinkubasi semalam pada suhu 37 oC. Selanjutnya satu koloni lup bakteri tersebut diinokulasikan pada 2 mL LB yang mengandung kanamisin 25 µg/mL dan diinkubasi pada suhu 37 oC dengan di-shaker dengan kecepatan 150 rpm selama semalam. Sebanyak 1.5 mL biakan dimasukkan pada tabung mikro 1.5 mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 1 menit pada 4 oC. Media dibuang, pelet
diresuspensi dengan 100 µL solution I dingin. Sebanyak 200 µL solution II ditambahkan dan tabung dibolak-balik lima kali dan segera simpan di es selama 5 menit. Selanjutnya sebanyak 150 µL solution III ditambahkan dan dicampur dengan cara divorteks selama 10 detik. Campuran tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 oC. Supernatan paling atas diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikro baru dan ditambah dengan 1X volume P:C (25:24). Selanjutnya divorteks dan disentrifugasi 12 000 rpm selama 2 menit pada suhu 4 oC. Supernatan diambil dan ditambah dengan 2X volume etanol absolut suhu ruang. Tabung divorteks kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rp selama 5 menit pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang dan pelet dikeringanginkan. Pelet dicuci dengan etanol 70% dingin dan disentrifugasi kemudian supernatan dibuang. Pelet dikeringanginkan kembali. Plasmid diresuspensi dengan ditambahkan air bebas nuklease. Plasmid disimpan pada suhu -20 oC hingga digunakan. Plasmid pET-28a yang diperoleh selanjutnya direstriksi menggunakan enzim BamHI dan SalI dengan teknik double digest (Thermo Scientific). Plasmid yang terpotong dielektroforesis pada gen agarose 1% dan dipurifikasi menggunakan HiYield Gel/PCR Fragmen Extraction Kit (Gel extraction protocol).
Ligasi gen aiiA dan plasmid pET-28a
Komposisi ligasi meliputi: 1 µL plasmid pET-28a, 1 µL fragmen gen aiiA, 1 µL bufer ligasi 10X, 6.67 µL air bebas nuklease, dan 0.34 µL T4 DNA ligase. Selanjutnya inkubasi pada suhu 4 ºC selama semalam. Hasil ligasi antara plasmid pET-28a dengan fragmen gen aiiA selanjutnya disebut pET-28a::aiiA.
Transformasi pET-28a::aiiA pada E. coli BL21 (DE3)
Penyiapan kompeten sel. Kompeten sel dilakukan dengan metode “Ultra- competent cell” yang dideskripsikan oleh Inoue et al. (1990). Sebanyak 1 koloni E. coli BL21 yang telah ditumbuhkan pada media LB agar (setelah inkubasi 16-20 jam pada 37 oC) diinokulasikan pada 25 mL LB dalam tabung 250 ml. Media yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi selama 6-8 jam pada 37 oC dengan kecepatan 200 rpm. Kultur tersebut digunakan sebagai starter. Sebanyak 2 ml kultur starter diinokulasi pada 250 ml SOB dalam tabung 1 liter dan diinkubasi semalam pada suhu ruang dengan dishaker kecepatan sedang 75 rpm. Pada pagi harinya diukur OD600 hingga OD mencapai 0.55. Setelah OD600 mencapai 0.55, biakan bakteri dipindahkan pada es selama 10 menit. Sel dipanen dengan disentrifugasi pada kecepatan 4 000 rpm selama 10 menit pada 4 oC. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan pada kertas serap selama 2 menit dengan kondisi tabung terbalik. Pelet sel diresuspensi dengan 80 mL Inou transformation buffer. Panen kembali sel dengan disentrifugasi 4 000 rpm selama 10 menit pada 4 oC. Supernatan dibuang dan pelet dikeringanginkan kembali selama 2 menit. Resuspensi kembali pelet sel dengan cara ditambahkan 20 ml Inou transformation buffer dingin dan ditambah dengan 1.5 mL DMSO. Selanjutnya inkubasi pada es selama 10 menit. Kompeten sel dibagi ke dalam aliquot 100 µL dan segera disimpan pada freezer -70 oC. Sesaat sebelum digunakan, aliquot kompeten sel diambil dari freezer -70 oC dan diletakkan pada es selama 10 menit.
Transformasi. Plasmid pET-28a::aiiA ditambahkan pada kompeten sel E. coli BL21 sebanyak maksimal 5%. Selanjutnya dicampurkan dengan cara dipipet. Dua perlakuan kontrol disiapkan yakni perlakuan tanpa plasmid dan perlakuan
dengan plasmid pET-28a tanpa sisipan. Tabung diinkubasi 10 menit dalam es kemudian di heat shock dalam inkubator suhu 42 oC selama 55 detik. Selanjutnya tabung segera dipindahkan dalam es selama 2 menit. Sebanyak 800 µL media SOC ditambahkan dalam masing-masing tabung. Hasil transformasi diinkubasi pada suhu 37 oC selama 45 menit dengan aerasi kuat 150 rpm dan sebanyak 200 µL disebar pada media SOB agar yang mengandung 20 mM MgSO4 dan 25 µg mL-1 kanamisin. Hasil transformasi diinkubasi pada suhu ruang hingga cairan meresap. Selanjutnya inkubasi pada 37 oC selama semalam (12-16 jam).
Konfirmasi keberhasilan transformasi
Konfirmasi keberhasilan transformasi pET28a::aiiA dilakukan dengan dua metode, yaitu PCR koloni menggunakan primer aiiA1/aiiA2 dan PCR dengan primer T7 pada sekuen pengapit DNA sisipan. PCR koloni dilakukan seperti pada metode deteksi gen aiiA namun template DNA berasal dari koloni hasil transformasi. PCR dengan primer T7 dilakukan dengan komposisi bahan yang digunakan sama dengan PCR sebelumnya, namun primer yang digunakan adalah primer T7 promotor dan primer T7 terminator. Adapun program PCR sekuen T7 yaitu pre-denaturation pada suhu 95 oC selama 5 menit, denaturation pada suhu 94 oC selama 1 menit, annealing pada suhu 55 oC selama 1 menit, extention pada suhu 72 oC selama 1.5 menit (diulang 35 siklus), dan final extention akhir pada suhu 72 oC selama 7 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% pada tegangan 75 volt selama 45 menit. Visualisasi DNA dilakukan dengan UV transilluminator mengikuti metode Sambrook et al. (1989).
Ekspresi Gen Penyandi AHL-laktonase pada E. coli BL21 (DE3)
E. coli BL21 (DE3) yang telah ditransformasi dengan pET-28a::aiiA ditumbuhkan kembali pada media LB agar yang mengandung antibiotik kanamisin 25 µg mL-1 dan diinkubasi selama semalam pada suhu 37 oC. Sebanyak satu koloni diambil dan diinokulasikan pada 3 ml LB yang mengandung antibiotik kanamisin 25 µg mL-1. Selanjutnya diinkubasi pada waterbath incubator dengan kecepatan 100 rpm suhu 37 oC selama semalam. Selanjutnya sebanyak 150 µL dari biakan tersebut diinokulasikan pada 15 ml LB yang mengandung kanamisin 25 µg mL-1 dan diinkubasi pada 37 oC dengan kecepatan 150 rpm. Setiap 30 menit OD600 diukur hingga mencapai 0.5. Biakan tersebut dibagi dalam dua bagian, yaitu: biakan tanpa diinduksi dan biakan yang diinduksi IPTG. Bagian biakan yang diinduksi, ditambah dengan IPTG dengan konsentrasi akhir 0.75 mM. Inkubasi dilanjutkan hingga 12 jam dengan suhu 37 oC dengan kecepatan 100 rpm. Sel dipanen tiap 4 jam dengan cara diambil 1.5 ml ke dalam tabung mikro dan disentrifugasi 6 000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 oC. Pelet sel disimpan pada freezer -70 oC hingga dianalisis proteinnya.
Analisis Protein AHL-laktonase dengan SDS-PAGE Penyiapan gel SDS-PAGE
Gel yang digunakan terdiri atas dua macam, yaitu: stacking gel dan separating gel. Bahan yang digunakan yaitu solution A (14.6 g acrylamide, 0.4 g bis-acrylamide, ddH2O hingga 50 ml), Bufer B (1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 0.4% SDS), Bufer C (0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 0.4% SDS), solution D (10% ammonium persulfat), dan TEMED. Semua bahan dicampurkan dan dicetak pada cetakan
SDS-PAGE. Adapun komposisi bahan pembuatan gel SDS-PAGE terjadi pada tabel 4.
Tabel 4 Komposisi bahan yang digunakan dalam SDS-PAGE
Bahan SeparatingGel 12.5% StackingGel
H2O 12 mL 7.2 mL Solution A 15 mL 1.8 mL Bufer B 9 mL - Bufer C - 3 mL Solution D 170 µL 45 µL TEMED 20 µL 20 µL SDS-PAGE Elektroforesis
Pelet bakteri yang telah disimpan dan akan dianalisis proteinnya terlebih dahulu ditambah dengan 300 µL bufer loading sampel (1 M Tris, 2 g SDS, Glicerol 17.4%, 10 mg Bromophenol blue, H2O hingga 45 ml, 5 ml 2- mercaptoethanol). Sampel divortek selama 15 menit. Sampel dipanaskan pada suhu 95 oC selama 10 menit. Sebanyak 50 µL sampel diambil dan dimasukkan pada gel SDS-PAGE. Elektroforesis SDS-PAGE dilakukan dengan 150 volt selama 4 jam dalam running buffer (15 g Tris-Base, 72 g Glycine, 5 g SDS, H2O hingga 1 liter).
Pewarnaan gel SDS-PAGE
Agar diambil dan diletakkan di wadah. Kemudian ditambah akuades 100 ml. Agar SDS-PAGE dioven dengan panas level tinggi selama 1 menit dan diagitasi selama 4 menit pada suhu ruang. Langkah ini diulang tiga kali dengan mengganti akuades. Selanjutnya sebanyak 20 ml PAGE-Blue staining (Fermentas) ditambahkan pada agar. Agar dioven pada level panas yang tinggi selama 30 detik. Agar diagitasi selama 60 menit. Selanjutnya dilakukan pembilasan. Pembilasan dilakukan dengan menambahkan 100 mL air pada agar dan diinkubasi selama 5 menit. Proses pembilasan diulang 3 sampai 5 kali hingga pita-pita protein terlihat jelas.
Analisis fungsional E. coli BL21 (DE3) rekombinan pET-28a::aiiA
Bio-assay anti-QS terhadap C. violaceum
Sebelum dilakukan pengujian terhadap D. dadantii, E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA diuji terhadap C. violaceum untuk mengetahui ekspresi gen aiiA. Pengujian dilakukan dengan supernatan dan pelet E. coli BL21 (DE3) rekombinan. Supernatan disiapkan dengan cara E. coli BL21 rekombinan disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 5 menit kemudian supernatan disaring menggunakan milipore 0.2 µm (Minisart, Sartorius Stediem Biotech, Germany). Metode yang digunakan dalam pengujian anti-QS yaitu metode disc diffusion assay dengan teknik double layer culture plate. Metode tersebut sama seperti metode untuk pengujian anti-QS pada bagian penapisan bakteri penghasil AHL-laktonase mengikuti metode Song et. al. (2012).
Bio-assay anti-QS dalam menghambat virulensi D. dadantii
Pengujian kemampuan E. coli BL21 (DE3) rekombinan plasmid pET- 28a::aiiA dilakukan pada kentang. E. coli BL21 (DE3) rekombinan ditumbuhkan terlebih dahulu pada LB 5 ml. Biakan diinkubasi pada shaker 150 rpm dan diukur OD600 hingga mencapai 0.5. Biakan diinduksi dengan IPTG dengan konsentrasi akhir 0.75 mM dan diinkubasi kembali hingga 8 jam. Pelet dan supernatan dipisahkan dengan cara disentrifugasi 10 000 rpm selama 10 menit. Pelet atau supernatant dari E. coli BL21 rekombinan plasmid pET-28a::aiiA dicampur dengan biakan D. dadantii (1:1). Sebanyak 20 µL campuran biakan diuji pada potongan kentang. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter busuk lunak dan dihitung tingkat hambatan relatif (THR) pada 24 dan 48 jam setelah inokulasi. Rancangan percobaan yang digunakan yaitu rancangan acak lengkap (RAL). Olah data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS statistics versi 17.0.