BAB III METODE PENELITIAN
3.3 Bahan dan Cara Kerja
Bahan penelitian adalah nyamuk Aedes aegypti betina dari rumah penduduk di wilayah endemis DBD di Medan, Sumatera utara, yaitu: Medan Helvetia, Medan Selayang, Medan Sunggal, Medan Baru dan Medan Amplas. Nyamuk ditangkap dari habitat istirahat di dalam rumah, terutama di tempat-tempat lembab dan gelap serta pakaian yang tergantung pada pagi hari pukul 07.00-11.00wib dan sore hari pukul 16.00-18.00 wib. Pengumpulan nyamuk dilakukan di rumah-rumah penderita DBD atau mantan penderita dan sekitarnya berdasarkan keterangan dari
Puskesmas dan Dinas Kesehatan setempat. Nyamuk ditangkap menggunakan aspirator. Nyamuk hasil tangkapan dibawa ke laboratorium dan dimatikan dengan cara dimasukkan ke dalam refrigerator dalam vial, setelah mati nyamuk disimpan pada suhu -700 C. Nyamuk akan digunakan sebagai bahan pemeriksaan virus Dengue. Virus yang akan diperiksa adalah virus DEN1.
Jumlah sampel minimal
n ≥ Z2 (0.5 – /2) x p x q e2
jika = 0,05 maka Z2 (0.5 – /2) = 1.96 dimana : e = tingkat ketepatan yang diinginkan = 10 % = 0,1
p = proporsi nyamuk Aedes aegypti yang mengandung virus Dengue q = 1-p = 1- 0,5= 0,5
n ≥ (1.96)2 x (0.5) x (0.5) (0.1)2
n ≥ 96
Di mana dalam hal ini karena tidak diketahui jumlah nyamuk Aedes aegypti yang mengandung virus Dengue, karena memang di Medan belum pernah dilakukan penelitian mendeteksi virus Dengue dalam tubuh nyamuk Aedes aegypti, maka sesuai rumus angka untuk p diambil 0,5 (Jalil,2006).
Sehingga sampel minimal yang diperlukan pada penelitian ini adalah 96 ekor nyamuk Aedes aegypti betina.
Alat dan bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah :
1. QIAamp MinElute Virus Spint Kit, terdiri dari: QIAamp MinElute Columns, Collection Tubes, bufer AL, bufer AW1 (concentrate), bufer AW2 (concentrate), bufer AVE, Protease Resuspension Buffer, Carrier RNA, QIAGEN® Protease. 2. Primer DEN 1 ( CGT CTC CAG TGA TCC GGG GG )
3. Etanol (96-100%) 4. Agarosa 5. SYBER safe-TM 6. 1X TAE bufer 7. Aquades 8. Blue juice 2X
9. Biosafety cabinet class II merk Esco class II type A2 10.Penggerus
11.Pipet tips dan mikropipet 12.Tabung eppendorf
13.Vortexer merk Maxi Mix II
14.Block heater merk Barnstead International
15.Micro wave
16.Microcentrifuge merk Sorvall Biofuge Primo R Centrifuge 17.Kulkas dan Freezer merk Sanyo
18.Alat elektroforesis
19.Mesin PCR merk Bio-rad 20.Alat gel imaging merek Bio-rad
3.3.1 Kerangka Kerja
Pengumpulan Nyamuk Aedes aegypti Ekstraksi RNA virus Dengue
RT-PCR dengan menggunakan primer DEN 1 Elektroforesis
Visualisasi
3.3.2 Ekstraksi RNA Virus Dengue
Sebelum melakukan ekstraksi, dilakukan terlebih dahulu persiapan terhadap bahan-bahan, antara lain :
1. Mempersiapkan Qiagen protease
1,4 bufer AVE ditambahkan ke dalam tabung yang berisi Qiagen protease , dicampur dan dipisahkan ke dalam 5-6 tabung eppendrof, masing-masing 250 µl (untuk 10 reaksi), lalu disimpan pada suhu -200 C.
2. Mempersiapkan bufer AL
310 µl bufer AVE ditambahkan ke dalam tabung berisi carrierRNA, dicampurkan dan dipisahkan ke dalam 5 tabung eppendrof masing –
3. Mempersiapkan Bufer AW-1
25 ml etanol 96-100% ditambahkan ke dalam bufer AW-1 dan disimpan pada suhu ruangan.
4. Mempersiapkan Bufer AW-2
30 ml etanol 96-100% ditambahkan kedalam bufer AW-2 dan disimpan pada suhu ruangan
5. Mencampur Medium Virus
DMEM (Drainase Enrich Medium) dimasukkan ke dalam tabung kultur 12 ml sebanyak 9,5 ml per tabung. Lalu ditambahkan 0,5 ml FBS ke dalam tabung tersebut dan disimpan pada suhu 4oC.
Adapun cara melakukan ekstraksi RNA virus Dengue dari nyamuk Aedes aegypti
adalah sebagai berikut:
Seekor nyamuk dengan menggunakan pinset steril di masukkan ke dalam tabung eppendorfyang berisi 300 µl medium virus (DMEM + FBS), nyamuk kemudian digerus dengan menggunakan penggerus steril. Setelah itu disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4oC. Lalu 200µl supernatant
hasil sentrifugasi diambil dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang telah diisi 25µl Qiagen protease. Setelah itu ditambahkan 200 µl bufer AL dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 56oC. Lalu disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 250 µl etanol , ditutup dan dicampurkan dengan menggunakan vortexer selama 15 detik. Setelah divortex, campuran tersebut
diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruangan. Lalu disentrifus lagi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
Setelah tabung eppendorf dikeluarkan dari mesin sentrifus, seluruh campuran tersebut dimasukkan ke dalam column dengan menggunakan mikropipet dan ditutup , lalu disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah itu
column dikeluarkan dari mesin sentrifus lalu collection tube yang mengandung
filtrat dibuang dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru. Kemudian dilakukan berturut-turut pencucian dengan bufer AW-1, bufer AW-2 dan etanol, dengan cara menambahkan 500 µl masing-masing larutan tersebut, lalu disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari mesin sentrifus, buang collection tube yang mengandung filtrat dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan (dry spin).
Setelah column dikeluarkan dari mesin sentrifus, buang kembali collection tube
yang mengandung filtrat dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru , tutupnya dibuka dan diinkubasi dalam 56oC selama 3 menit. Kemudian masukkan
column ke dalam tabung microcentrifuge 1,5 ml, dimasukkan 100 µl bufer AVE ke
tengah-tengah membran, lalu ditutup dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruangan. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Setelah itu column dibuang, dan tabung microcentrifuge yang mengandung RNA yang telah diekstraksi disimpan dalam suhu -70oC.
3.3.3 Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
RT-PCR adalah teknik yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya RNA virus Dengue serotipe 1 (DEN 1) dengan menggunakan primer DEN 1.
Pertama-tama dipersiapkan Master mix yang dibuat dengan mencampurkan 25 µl 2x reaksi mix (bufer yang terdiri dari 0.4 mM dNTP dan 3.2 mM MgSO4) dengan 20 µl larutan yang berisi campuran dari 1 µl dari 10 µM primer DEN1, 2 µl superscript III RT, 4 µl MgSO4 dan aquades (Eva Haris et al,1998). Master mix ini dicampurkan dengan pipeting dan di spin down.
RNA hasil ekstraksi dipersiapkan dengan memanaskan tabung pada 65o C selama 5 menit dengan menggunakan block heater, kemudian ditempatkan di dalam es selama mempersiapkan master mix. Kemudian 5 µl RNA hasil ekstraksi ditambahkan ke dalam master mix, kemudian disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Lalu dimasukan ke dalam mesin PCR.
Langkah Reverse Transcriptase (RT) dilakukan selama 30 menit untuk menghasilkan cDNA, kemudian diamplifikasi dengan langkah Polymerase Chain
Reaction (PCR) berikut : 92o C selama 3 menit untuk denaturasi inisial, 82oC
selama 430 detik untuk denaturasi, 53oC selama 30 detik untuk annealing dan 72oC selama 1 menit untuk ekstension. Siklus ini diulangi sebanyak 40 kali sebelum final
extension 72oC selama 5 menit. Produk PCR ini disimpan pada suhu 4oC sebelum
3.3.4 Elektroforesis
Untuk menentukan jenis serotype virus Dengue yang telah diamplifikasi maka dilakukan elektroforesis. Cara melakukan elektroforesa adalah sebagai berikut:
Mula-mula dibuat agarose 2% dengan cara : 10 ml 1X TAE bufer dicampur dengan 100 ml aquades (pengenceran 10x), lalu 50 ml larutan 1X TAE bufer tersebut dicampurkan dengan 1 gram agarose. Lalu dipanaskan dalam microwave
sampai mendidih, kemudian ditambahkan 1:1000 SYBER safe-TM dan tuang dalam cetakan agarose gel yang telah disediakan dengan jumlah sumuran (well) sesuai kebutuhan.
Setelah gel agarose mengeras, dimasukkan ke dalam tangki (chamber) elektroforesis yang berisi 1X TAE buffer. Kemudian 5-10 µl hasil PCR dicampur dengan 1 µl blue juice 2X dan dimasukkan ke dalam sumur pada pada gel agarose, lalu masukkan pula secara berturut-turut 10 µl marker, 5-10 µlkontrol positif dan 5- 10 µl kontrol negatif pada sumur-sumur berikutnya. Kontrol positif adalah hasil amplifikasi PCR yang berisi master mix yang dicampur RNA virus DEN 1 dan kontrol negatif adalah hasil amplifikasi PCR yang berisis master mix yang dicampur
nucleus free water.
Power supply kemudian dinyalakan pada posisi 100 V, 400 mA dan
3.3.5 Visualisasi
Setelah dielektoforesis, gel agarosa dimasukkan ke dalam alat gel imaging untuk melihat hasil amplifikasi RNA virus Dengue yang dilakukan dengan teknik RT-PCR.
Pita molekul yang terlihat pada gel agarosa menandakan adanya segmen DNA, kemudian pita DNA tersebut dibandingkan dengan pita yang ada pada kontrol positif dan marker.