Ekstraksi isozim dilakukan di Laboratorium Ilmu Hayati, IPB Bogor. Sis-tem isozim yang dianalisis adalah PER, AAT, EST, dan ACP. Tahapan esktraksi dan isolasi isozim adalah penyiapan bahan, pembuatan larutan bufer, gel pati, eks-traksi enzim, elektroforesis, pewarnaan, dan fiksasi gel.
Penyiapan bahan
Pada enam lokasi (Banda, Ambon, Luhu, Ternate, Tidore, dan Bacan) di-pilih enam pohon pala yang padanya diambil sampel daun untuk ektraksi isozim. Daun berumur sedang pada cabang utama kedua dari bawah dipilih sebagai sam-pel. Daun terpilih dibawa dari lokasi ke laboratorium dalam termos berisi es ker-ing untuk menjaga kesegarannya.
Pembuatan larutan bufer
Ada tiga macam larutan bufer yang digunakan dalam ekstraksi isozim yai-tu bufer pengekstrak, bufer gel, dan bufer elektroda. Bufer pengekstrak terdiri atas larutan Tris-HCl bufer pH 7,5; 7,5 mM sukrosa (w/v), dan PVP-40 (w/v). Bufer gel tersusun dari larutan 5 mM L-histidin yang diatur pH-nya dengan Tris-HD hingga 6,0; sementara bufer elektroda terdiri atas asam sitrat monohidrat dan 150 mM Tris-HD bufer pH 7,5.
Ekstraksi enzim
Daun sekitar 1 g dipotong kecil-kecil kemudian dimasukkan ke dalam mortar yang bagian luarnya didinginkan dengan es batu. Ke dalam sampel ditam-bahkan 1,2 ml bufer pengekstrak. Sampel digerus sampai halus kemudian dima-sukkan ke dalam tabung ependorf-1,5 ml, kemudian disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 5 oC. Supernatan diambil dengan pipet mikro lalu dimasukkan ke dalam tabung ependorf kemudian disimpan dalam freezer untuk tahap berikutnya.
Pembuatan gel pati
Sebelum gel dibuat, cetakan gel diolesi dengan parafin cair untuk mempermudah melepas gel dari cetakan. Pati 10% dan larutan bufer gel dimasukkan ke labu kemudian dididihkan di atas penangas air sambil diaduk
merata sampai gel matang (waktunya sekitar 10 menit). Untuk membebaskan gel dari udara terperangkap, cairan gel panas divakum segera selama 10 menit kemu-dian dituang dalam cetakan lalu dibiarkan pada suhu kamar hingga mengeras menjadi gel.
Elektroforesis sampel
Ujungkertas saring dengan lebar sesuai lebar sumur gel dicelupkan ke da-lam ekstrak sampel kemudian diselipkan ke sumur gel hingga seluruh sampel mengisi sumur. Sebagai kontrol mobilitas elektroforesis digunakan bromofenol biru yang diisikan pada salah satu sisi ujung sumur gel. Gel ditutup dengan plas-tik dan selanjunya dielektroforesis selama 5 jam dengan kuat arus konstan 18 mA. Pewarnaan dan fiksasi
Kertas saring yang ada di sumur dibuang dan gel diiris secara horizontal menjadi dua potongan untuk pewarnaan dua macam enzim. Gel elektroforesis kemudian direndam dalam larutan pewarna. Lama waktu perendaman sekitar 1 sampai 2 jam. Larutan pewarna untuk isozim tertentu bersifat spesifik dan harus dipersiapkan dalam kondisi segar. Metode pewarnaan mengikuti metode Wendel (1989). Komposisi sistem pewarna enzim PER, AAT, EST, dan ACP tampak pa-da Tabel 47.
Tabel 47 Komposisi bahan untuk pewarnaan isozim
Sistem enzim Bahan Jumlah
PER 3-amino-9 ethylcarbazole 50 mg
0,1 M CaCl2 2 ml
30% H2O2 0,2 ml
0,05 Natrium asetat (pH 5) 95 ml
AAT Asam aspartat 250 mg
Asam α – ketoglutarat 150 mg
Fast Blue BB salt 150 mg
ACP Fast Garnet GBC salt 100 mg
Buffer Natrium asetat (pH 5) 100 ml
0,1 M CaCl2 2 ml
1% α – naphthyl acid phosphatse 2 ml
EST Larutan fosfat (NaH2PO4) 250 mg
Larutan fosfat (Na2HPO4) 250 mg
Fast Blue RR salt 150 mg
Setelah pewarnaan, gel dicuci dengan air mengalir hingga bersih kemudian difiksasi menggunakan larutan yang terdiri atas etanol, akuades, asam asetat, dan gliserol dengan proporsi 5:4:2:1. Pita-pita isozim yang tampak pada gel difoto untuk analisis kuantitatif selanjutnya.
Analisis RAPD
Bahan tanaman. Analisis RAPD dilakukan di Laboratorium PKBT (Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika) IPB, Bogor. Daun tanaman pala yang dikumpulkan dari enam lokasi (Ambon, Banda, Luhu, Ternate, Tidore, dan Bacan) di dua daerah (Maluku dan Maluku Utara) digunakan sebagai bahan untuk ektraksi DNA. Dua tanaman dipilih per lokasi sampling.
Isolasi DNA. Total DNA pala diekstraksi menggunakan metode CTAB (Doyle dan Doyle 1987) dan konsentrasinya diukur secara spektrofotometri pada λ 260 nm. Amplifikasi DNA dilakukan mengikuti prosedur Williams et al. (1990) memakai primer OPE-10 (GACTCTCAGG) dan OPE-11 (GAGTCTCAGG).
Pemurnian DNA. Pemurnian DNA menggunakan metode Sambrook et al. (1989). Larutan DNA ditambah 1 μl RNAse dan dibiarkan pada suhu kamar selama 2 jam, lalu ditambahkan fenol kloroform isoamilalkohol dingin sebanyak 100 μl dan disentrifus pada 12 000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipipet ke dalam tabung baru dan ditambahkan kloroform isoamilalkohol dengan volume yang sama, selanjutnya disentrifus lagi pada 12.000 rpm selama 15 menit. Super-natan dipipet ke dalam tabung evendorf baru kemudian ditambahkan natrium ase-tat 3 M pH 5,2 sebanyak 1/10 volume dan isopropanol dingin sebanyak 2,5 volu-me. Larutan dikocok hingga homogen kemudian dalam freezer selama 60 menit atau semalam. Larutan disentrifus selama 15 menit pada 12.000 rpm, pelet yang diperoleh ditambahi etanol 70% sebanyak 100 μl dan disentrifus selama 5 menit pada 12.000 rpm. Cairan dibuang dan pelet dikeringkan dengan cara membalikkan tabung. Pelet yang sudah kering angin diberi 100 μl air bebas ion kemudian diko-cok hingga larut sempurna.
Uji kualitas DNA. Gel agarose 0,8% dibuat dengan mencampur 0,32 g agarosa dan 40 ml larutan TAE 1x, kemudian dipanaskan sampai mendidih. Laru-tan dibiarkan sampai hangat lalu dituang ke dalam cetakan gel yang telah disisipi
sisir untuk cetakan sumur gel. Gel dibiarkan selama 1 jam hingga memadat. Se-banyak 5 μl DNA hasil ekstraksi dicampur dengan 1 μl larutan pewarna kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Elektroforesis dilakukan dengan alat elektrofo-resis horizontal pada tegangan 100 volt selama 30 menit. Gel yang telah dieletro-foresis direndam dalam larutan ethidium bromida 0,1% kemudian dibilas dengan air. Pita DNA diamati di atas UV transiluminator.
Uji kuantitas DNA. Larutan DNA sebanyak 20 μl dimasukkan ke dalam kuvet dan ditambahkan 1.900 μl akuades steril. Nilai absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kerapatan optik (optical density, OD) 260 menunjukkan penyerapan UV oleh nukleotida, sedangkan OD 280 menunjukkan penyerapan UV protein. Molekul DNA dikatakan murni jika ratio OD 260 terhadap OD 280 berkisar antara 1,8 sampai 2,0 (Sambrook et al. 1989). Konsentrasi DNA dihitung dengan formula:
[DNA] (μg/ml) = A260 x 50 x faktor pengenceran.
Amplifikasi PCR
PCR (Polymerase chain reactions) dilakukan menggunakan volume reaksi 25 μl yang berisi 10 mM Tris-HCl pH 9;0; 150 mM KCl; 1,8 mM MgCl2 dan 0,1 mM masing-masing untuk dATP, dTTP, dGTP dan dCTP; 0,3 μM primer, 50 ng DNA genom dan 0,5 unit Taq polimerase. Amplifikasi menggunakan mesin PCR ASTEC Thermal PC 707. Amplifikasi PCR dimulai dengan inisiasi denaturasi DNA selama 1,5 menit. Amplifikasi selanjutnya dilakukan sebanyak 45 siklus, dimulai pada suhu 94 0C 1 menit, 37 0C 1 menit, 72 °C 2 menit, dan tahap akhir siklus pertama 72 0C 4 menit. Proses amplifikasi akan berulang hingga mencapai 45 siklus. Fragmen produk amplifikasi dipisahkan dalam gel agarosa 1,5% dan diwarnai dengan etidium bromida (Etbr) 0,5 mg per ml. Elektroforesis dilakukan pada voltase 5 v/cm selama 2,5 jam lalu gel difoto di atas UV transiluminator.
Produk amplifikasi yang berupa pita-pita DNA diskor secara visual dan diberi nilai 1 untuk ada pita, dan 0 untuk tidak ada pita. Berdasarkan skor biner kemudian dihitung kemiripan pola pita DNA di antara sampel pala.
Analisis Data
Pita-pita isozim dan DNA diberi skor biner, yaitu 1 untuk ada pita, dan 0 untuk tidak ada pita. Indeks kesamaan (SI) pola pita DNA dihitung menurut for-mula:
SI= 2Nxy/(Nx+ Ny)
Nxy adalah banyaknya pita yang muncul pada individu x dan y bersamaan, Nx ada-lah banyaknya pita yang muncul pada individu x dan Ny adalah banyaknya pita pada individu y (Nei 1978). Matriks korelasi (kesamaan) selanjutnya diarahkan pada analisis komponen utama untuk lebih memperjelas hubungan antara indivi-du. Analisis statistik dilakukan menggunakan SAS (SAS 1996).
