Bahan-bahan yang digunakan adalah kentang, glukosa, agar, beras, tanah, tandan kosong kelapa sawit (TKKS), pupuk kandang, air destilata, alkohol 70%, CaCl2, NaOH, buffer asetat, p-nitrofenilfosfat (pNPP), p- nitrofenol (pNP), pereaksi Salkowski (FeCl3.6H2O 0,5 M, H2SO4 pekat), pupuk NPK, T. harzianum, dan L. rubellus dari Laboratorium Mikrob dan Bioproses BPBPI.
Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, cawan petri, neraca kasar, neraca analitik, bak plastik berukuran 40 x 12 x 8 cm, botol jam, hemasitometer, vortex, mikroskop cahaya, autoklaf, oven, laminar air flow cabinet, pipet Mohr, inkubator, Erlenmeyer, sentrifus Eppendorf 5417R, gelas ukur, polybag, spektrofotometer UV-Vis dan pipet Eppendorf.
Metode Penelitian Penyiapan Tanah dan Cacing Tanah
Bak plastik berukuran 40 x 12 x 8 cm sebanyak 4 buah. Pupuk kandang ditimbang sebanyak 200 gram dan dicampur dengan 200 gram TKKS yang telah dicacah. Setelah itu, dimasukkan ke dalam bak plastik dan dicampur dengan tanah hingga berat akhirnya mencapai 7 kg dan diaduk hingga homogen. Kadar air campuran diatur menjadi 60-90% dengan cara menambahkan air sebanyak 300 mL pada masing-masing bak plastik, kemudian diaduk kembali hingga homogen (Palungkun 1999). Cacing tanah yang telah diperoleh dari lahan di belakang Laboratorium Mikrob dan Bioproses BPBPI dimasukkan ke dalam masing-masing bak plastik sebanyak 10 ekor. Bak plastik yang telah berisi cacing tanah dan media pemeliharaannya, disimpan pada tempat yang tidak terkena sinar matahari. Penyiraman dilakukan tiga hari sekali sambil diaduk-aduk untuk mempertahankan kelembaban dan jumlah oksigen yang tersedia.
Pembuatan Media
Potato Dextrose Agar (PDA). Media
umum PDA dibuat dengan cara sebagai berikut (Fassatiova 1986). Kentang dikupas, dibersihkan, dicacah, dan ditimbang 200 gram. Air diukur 1 L dengan menggunakan gelas ukur dan dimasukkan ke dalam wadah untuk merebus air, kemudian dicampur dengan ketang yang telah ditimbang. Campuran air dan kentang direbus hingga mendidih. Setelah mendidih, air rebusan kentang disaring dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 1 L, dicampur dengan 20 gram gula, 0,07 gram pepton dan diaduk hingga larut, kemudian dibagi ke dalam 2 Erlenmeyer 500 mL. Larutan ini merupakan media Potato Dextrose Broth (PDB). Media PDA dibuat dengan cara menambahkan sebanyak 10 gram agar ke dalam masing-masing Erlenmeyer dan dipanaskan sambil diaduk hingga homogen. Selanjutnya media PDA ini disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC, 1 atm selama 15 menit.
Pemeliharaan Jamur T. harzianum
Pemeliharaan Stok Kultur (Fassatiova 1986). Media PDA yang telah steril, dituang pada cawan petri yang telah steril dan dibiarkan hingga padat pada suhu kamar. Media PDA disimpan pada suhu 4-8 oC untuk masa penyimpanan selama dua minggu. Sebanyak satu ujung jarum spora jamur T. harzianum ditaruh ke dalam media PDA padat dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu sebagai kultur stok
Pemeliharaan Stok Kerja (Fassatiova 1986). Kultur T. harzianum dari cawan petri (stok kultur) dipindahkan ke dalam botol jam yang berisi nasi setengah matang sebanyak 1 spatula secara steril dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu sebagai stok kerja. Penghitungan Jumlah Spora
Penghitungan jumlah spora dilakukan dengan menggunakan metode mikroskopi langsung (Hadioetomo 1985). Sebanyak 0,1 gram spora T. harzianum yang dibiakkan pada media nasi setengah matang ditimbang, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9,9 mL air steril dan disuspensikan dengan vortex (a), kemudian 100 μL suspensi ini diencerkan ke dalam 9,9 mL air steril sehingga diperoleh pengenceran 10-4 (b). Setelah itu, 100 μL larutan b dicampur dengan 9,9 ml air steril, dikocok dengan vortex dan diperoleh pengenceran 10-6 (c). Terakhir, 100
6
μL larutan c dicampur dengan 9,9 mL air steril, dikocok dengan vortex dan diperoleh pengenceran 10-8.
Permukaan hitung hemasitometer dibersihkan dengan kertas lensa, setelah itu kaca tutup hemasitometer diletakkan di atas hemasitometer. Sebanyak 1 tetes suspensi T. harzianum pada pengenceran 10-8, diteteskan pada lekukan berbentuk V pada tepi kaca tutup hemasitometer. Selanjutnya hemasitometer diletakkan di atas pentas mikroskop dan diamati dengan obyektif berkekuatan rendah. Jumlah spora pada kotak bagian tengah yang berukuran 1 mm dihitung dengan teliti. Hasil perhitungan yang diperoleh digunakan untuk menentukan jumlah spora pada langkah selanjutnya. Jumlah spora T. harzianum per gram dihitung dengan cara mengalikan hasil perhitungan dengan angka 5 x 103 x faktor pengenceran. Analisis Produksi IAA (Indole Acetic Acid) oleh Trichoderma harzianum.
Analisis produksi IAA diukur dengan menggunakan metode Gordon dan Webber (1950). T. harzianum yang ditumbuhkan pada media PDA dipindahakan ke dalam botol jam yang berisi media PDB secara aseptik. Pada hari ke-3 dan ke-6 diambil 3 mL biakan dari botol kemudian dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf masing-masing 1,5 mL. Suspensi diendapkan dengan sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 11000 g. Sebanyak 1 mL supernatan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambah pereaksi Salkowski (FeCl3.6H2O 0,5 M dalam H2SO4 pekat) dan dikocok dengan menggunakan vortex. Larutan didiamkan selama 30 menit untuk pengembangan warna, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 530 nm. Kadar IAA dihitung dengan menggunakan bantuan kurva deret standar regresi linier IAA.
Penentuan Aktivitas Fosfatase
Penentuan Aktivitas Fosfatase Asam (Joner & Jabkosen 1992). Sebanyak 1 g kascing dimasukkan ke dalam 12 mL buffer asetat 0,1 M pH 5,2 berisi p-nitrofenilfosfat (pNPP) 1 mg/mL sebagai substrat pada botol kocok, kemudian diinkubasi pada shaker water bath dengan suhu 35 oC sambil dikocok selama 1 jam. Setelah itu reaksi enzimatik dihentikan dengan penambahan 10 mL NaOH 0,5 M dan 2 mL CaCl2 0,5 M, dibiarkan
mengendap, lalu disaring. Perubahan warna yang terjadi diamati dan hasil yang positif ditandai dengan terbentuknya warna kuning.
Penentuan Aktivitas Fosfatase Basa. Aktivitas fosfatase basa diukur dengan menggunakan metode Joner dan Jabkosen (1995). Sebanyak 1 gram kascing dimasukkan ke dalam 12 mL NaHCO3 0,1 M pH 8,5 berisi p-nitrofenilfosfat (pNPP) 1 mg/mL sebagai substrat. Setelah itu, diinkubasi pada shake water bath bersuhu 35 oC sambil dikocok selama 1 jam. Selanjutnya reaksi enzimatik dihentikan dengan penambahan 10 mL NaOH 0,5 M dan 2 mL CaCl2 0,5 M, dibiarkan mengendap, lalu disaring. Perubahan warna yang terjadi diamati dan hasil yang positif ditandai dengan terbentuknya warna kuning. Blanko dibuat dengan perlakuan yang sama tetapi tanpa penggunaan substrat pNPP. Formulasi Pupuk Bioorganik
Campuran T. harzianum dan Gambut. Pemanfaatan gambut sebagai bahan pembawa mikrob telah dilaporkan memberikan hasil yang baik yaitu dalam hal ketahanan yang tetap tinggi dengan masa penyimpanan beberapa bulan (Saraswati et al., Suharyanto 1995). Cara kerjanya adalah sebanyak 0,5 gram spora T. harzianum ditimbang, dicampur dengan gambut sebanyak 5 kg dan dicampur hingga homogen untuk mendapatkan 109 spora/g gambut (a). Selanjutnya, 500 gram campuran gambut dan spora (a) dicampur dengan 4,5 kg gambut, diaduk hingga homogen untuk mendapatkan jumlah spora sebesar 108 spora/g gambut (b). Campuran gambut dan spora b diambil, ditimbang sebanyak 500 gram, dan ditambahkan gambut 4,5 kg sehingga diperoleh jumlah spora 108 spora/gram gambut.
Campuran Kascing dan Gambut (yang telah mengandung spora T. harzianum). Pupuk bioorganik formula A dibuat dengan mencampurkan 1.5 kg gambut yang mengandung spora T.harzianum 109, 108 dan 107 spora/gram dengan 0,5 kg kascing, sedangkan pupuk bioorganik formula B dibuat dengan mencampurkan 1,8 kg gambut yang mengandung spora T. harzianum dengan 200 gram kascing.
Uji Pertumbuhan Tanaman Tomat dan Jagung
Jagung. Sebanyak 24 buah polybag ukuran 250 gram dilabel dan diisi dengan tanah steril. Setelah itu pada masing-masing polybag ditambahkan 2 gram pupuk
7
bioorganik formula A, 2 gram formula B, 2 gram pupuk yang terdiri atas 50% NPK dan 50% pupuk bioorganik formula A serta 2 gram pupuk yang merupakan campuran 50% pupuk NPK dengan 50% pupuk bioorganik formula B. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Sebagai kontrol positif (K+) digunakan pupuk NPK dengan dosis 2 gram/polybag 250 gram (Setiawan & Widyastuti 1999), sedangkan kontrol negatif (K-) tanpa penambahan pupuk. Benih jagung dengan umur yang sama ditanam pada masing-masing polybag, dan disimpan di rumah kaca. Penyiraman dilakukan setiap hari. Tinggi batang sebelum ditanam, diukur dan dicatat terlebih dahulu. Perubahan tinggi batang diamati, diukur dan dicatat dua hari sekali selama 1 bulan.
Tomat. Sebanyak 24 buah polybag ukuran 250 gram dilabel dan diisi dengan tanah steril. Setelah itu pada masing-masing polybag ditambahkan 2 gram pupuk bioorganik formula A, 2 gram formula B, 2 gram pupuk yang terdiri atas 50% NPK dan 50% pupuk bioorganik formula A serta 2 gram pupuk yang merupakan campuran 50% pupuk NPK dengan 50% pupuk bioorganik formula B. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Sebagai kontrol positif (K+) digunakan pupuk NPK dengan dosis 2 gram/polybag 250 gram (Setiawan & Widyastuti 1999), sedangkan kontrol negatif (K-) digunakan polybag tanpa penambahan pupuk. Benih tomat dengan umur yang sama ditanam pada masing-masing polybag, dan disimpan di rumah kaca. Penyiraman dilakukan setiap hari. Tinggi batang sebelum ditanam, diukur dan dicatat terlebih dahulu. Perubahan tinggi batang diamati, diukur dan dicatat dua hari sekali selama 1 bulan.
Analisis Statistika
Analisis statistika yang digunakan adalah rancangan percobaan dua faktor dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL). Model rancangannya (Mattjik & Sumertajaya 2002): Yij = μ + τi + εij
Yij = Pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
μ = Pengaruh rataan umum τ = Pengaruh perlakuan ke-i
ε = Pengaruh acak pada perlakuan ke-i dan
ulangan ke-j
Rancangan ini digunakan pada tinggi, bobot basah tanaman dan panjang akar
tanaman. Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA (Analysis of varience) pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf α 0,05. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan. Semua data dianalisis dengan SPSS 15.0.