BAHAN DAN METODE Bahan

Bahan

Sayuran golongan brassica dibeli dari pasar tradisional di kota Makassar, Indonesia.

Bahan kimia diperoleh dari toko kimia di kota Makassar, Indonesia.

Metode Penelitian

Penelitian dimulai dengan ekstraksi enzim dari beberapa jenis sayuran golongan brassica. Sayuran pertama-tama dihaluskan dengan 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) menggunakan blender, kemudian disaring dengan kain saring, filtrat yang diperoleh kemudian disentrifus pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit, dan supernatant ditambahakan 80% ammonium sulfat. Setelah 24 jam, dilakukan sentrifus untuk mengumpulkan protein, kemudian dibilas dengan

sedikit 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0), dan kemudian didialisis pada suhu 5^oC menggunakan air destilat selama 36 jam. Selama proses dialisis, air destilat diganti sebanyak 4 kali kemudian disentrifus lagi sehingga diperoleh larutan enzim.

Larutan enzim yang diperoleh kemudian diukur aktivitas enzimnya : Aktivitas PhO.

Aktivitas PhO diukur dengan menggunakan metode spektrofotometrik berdasarkan perbedaan spektra (Fujita et al., 1993). Pengukuran dimulai dengan mencampur 0.5 mL dari 0.2 mM larutan phloroglucinol , larutan

1.4 mL dari 0.1 M potassium phosphate/0.1 M sodium hydrogen phosphate, dan

0.1 mL larutan enzim. Aktivitas PP. Aktivitas PPO diukur dengan menggunakan metode pengukuran warna (colorimetric) (Yang et al., 2000). Pengukuran dimulai dengan mencampur 0.5 mL dari 10 mM beberapa macam larutan polyphenol (pyrogallol, gallic acid, catechol, chlorogenic acid, DL-DOPA, dopamine, dan resorcinol), 4.0 mL dari 0.1 M larutan phosphate (pH 7.0), dan 0.5 mL larutan enzim. Setelah 5 menit diinkubasi pada suhu 30^oC, kemudian campuran larutan diukur pada absorbansi 420 nm. Aktivitas POD.

Aktivitas PPO diukur dengan menggunakan metode pengukuran warna (colorimetric) (Fujita et al., 1995).

Pengukuran dimulai dengan mencampur 0.5 mL dari 0.1 M larutan guaiacol, 4.1 mL dari 0.1 M larutan phosphate (pH 6.0), 0.2 mL dari 0.1% hydrogen peroksida dan 0.2 mL larutan enzim.

Setelah 2 menit inkubasi pada suhu 30^oC kemudian campuran larutan diukur pada absorbansi 470 nm. Pengukuran protein. Kandungan protein diukur berdasarkan metode Lowry modifikasi oleh Hartree (Hartree, 1972) menggunakan bovin serum albumin sebagai standar.

Kandungan protein diukur

pada 280 nm dan total protein diukur pada 650 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tabel 1. Substrate specificity PPO beberapa sayuran golongan brassica dari Indonesia

kol brokoli pak sawi sawi lobak

1,3,5-trihydroxybenzenes:

resorcinol 00.0 00.0 00.0 00.0 00.0 00.0 00.0

Tabel 2. Substrate specificity PPO pada buah dan sayuran

2000) 2001) al., 2007) 2008) 2006) 2011)

o-diphenols

catechol 76 54 34.0 100 100 39 35 86 100

4-methylcatechol 62.76 88.50

chlorogenic acid 100 24.5 5.3 1.89 53.40 100 6.5 80

DL-DOPA

caffeic acid 2.0 0.7 5.92 2.30 42

D-catechin 70 35.6 11.5 37

pyrogallol 70 5.5 1.4 0 15

gallic acid 72 0 0 0 0 73 70.1

1,3,5-trihydroxybenzenes:

Phloroglucinol 0 0 0 0.16 0 0 0

Tabel 1 menunjukkan substrate specificity PPO dari crude enzyme beberapa sayuran golongan brassica. PPOs dari kol, brokoli, dan bunga kol PPOs kuat mengoksidasi 1,3,5-trihidrosibensen seperti phloroglucinol dan phloroglucinol carboxylic acid, tetapi tidak mengoksidasi 1,2,3- trihidrosibensen seperti pyrogallol dan gallic acid. Dilain sisi, PPOs dari pak choy, sawi putih, sawi hijau dan lobak juga kuat mengoksidasi 1,3,5- trihidrosibensen, tetapi memiliki sedikit aktivitas pada pyrogallol. Tabel 1 juga menunjukkan bahwa semua sayuran golongan brassica yang diuji tidak memiliki aktivitas pada o-diphenol. Hal ini berbeda pada hasil penelitian pada beberapa sayuran dan buah pada Tabel 2, dimana semua PPO kuat mengoksidasi o-diphenol, tetapi, jumlah aktivitas pada setiap compound berbeda menurut varietasnya. Sebagai contoh, garland chrysanthemum dan Japanese butterbur kuat mengoksidasi chlorogenic acid;

banana pulp (Yang et al., 2000), banana peel (Yang et al., 2001) dan edible yam (Fujita et al., 2006) kuat mengoksidasi dopamine; red Swiss chard leaves kuat mengoksidasi L-DOPA (Gao et al., 2009). Catechol ditemukan sebagai substrat utama pada broccoli florest Dziki et al., 2007) butter lettuce (Gawlik-Dziki et al., 2008) dan cherry pulp (Jia et al., 2011). Substrat yang dominan pada buah dan sayuran berbeda menurut asal tanamannya. (Tabel 1 dan 2). Menurut Yoruk and Marshall (2003) bahwa PPO aktif pada substrat yang cocok dengan jenis enzim. Jumlah gugus hidroksil dan posisi pada cincin benzen sangat mempengaruhi aktivitas katalitik pada enzim.

Tabel 3. Distribusi PhO and POD pada sayuran golongan brassica

Sayuran Brassica

specific activity (unit/mg protein)

PhO POD

sawi putih (Brassica campestris L.) 0.140.01 3.40.01

pak choy (Brassica campestris L.) 0.640.02 5.80.01

sawi hijau (Brassica rapa L. (Chinensis Group)) 1.700.10 9.01.00

bunga kol (Brassica oleracea L.) 20.71.00 40.02.00

brokoli (Brassica oleracea L.) 14.41.10 41.04.00

lobak (Raphanus sativus L.) 22.03.00 52.06.00

kol (Brassica oleracea L.) 13.60.51 60.08.00

Tabel 3 menunjukkan bahwa enzim dari semua sayuran yang diuji memiliki dua sisi aktif yaitu phloroglucinol oxidase (PhO) dan peroxidase (POD). Dari 7 varietas sayuran yang diuji menunjukkan variasi jumlah aktivitas enzim PhO yaitu antara 0.14 sampai 22.0 unit/mg protein. Kol memiliki aktivitas PhO yang tertinggi dibandingkan jenis sayuran lain yang diuji yaitu 22.0 unit/mg protein.

Tingkatan aktivitas PhO dari beberapa jenis sayuran golongan brassica yang diuji adalah berurut sebagai berikut: Lobak > bunga kol > brokoli > kol > sawi hijau >

pak choy > sawi putih. Di lain sisi, kol PPO menunjukkan aktivitas tertinggi pada POD, yaitu 60 unit/mg protein. Tingkatan aktivitas POD dari beberapa jenis sayuran golongan brassica yang diuji adalah berurut sebagai berikut: kol > lobak

> brokoli > bunga kol > sawi hijau > pak choy > sawi putih.

KESIMPULAN

PPO dari beberapa sayuran golongan brassica diperoleh dari preparasi menggunakan 80 % amonium sulfat dan kemudian dilakukan analisis distribusi PhO. Kol, brokoli, dan bunga kol PPO kuat mengoksidasi 1,3,5- trihidrosibensen, tetapi tidak mengoksidasi o-difenol dan 1,2,3-trihidrosibensen. Dilain sisi, PPOs dari pak choy, sawi putih, sawi hijau, dan lobak kuat mengoksidasi 1,3,5-trihidrosibensen, tetapi memiliki aktivitas yang rendah pada pyrogallol.

Dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa PPOs yang terdistribusi pada semua sayuran golongan brassica adalah tipe baru dari PPO yaitu “phloroglucinol oxidase (PhO)”. Dan enzim ini memiliki dua aktivitas yaitu PhO dan POD.

DAFTAR PUSTAKA

Cartea, M.E.; Francisco, M.; Soengas, P.; Velasco, P. 2011. Phenolic compounds in Brassica vegetables. Molecules 16, 251280.

Fujita, S.; Tono, T., 1980. Peroxidase activity of phloroglucinoloxidase from Satsuma mandarin fruits and effect of metal ions on the enzyme activity.

Nippon Nogeikagaku Kaishi, 54, 201208.

Fujita, S.; Tono, T., 1980. Purification of phloroglucinoloxidase from turnip and its properties. Nippon Nogeikagaku Kaishi, 54, 429435.

https://www.jstage.jst.go.jp/article/nogeikagaku1924/54/6/54_6_429/_pdf Fujita, S.; Kawahara, H.; Nazamid, S.; Tono, T., 1993. Spectrophotometric

determination of phloroglucinoloxidase activity based on difference spectra.

Bull. Fac. Agric. Saga Univ., 74, 8188.

https://kaken.nii.ac.jp/d/p/03660029/1993/6/en.ja.html

Fujita, S.; Saari, N.; Maegawa, M.; Tetsuka, T.; Hayashi, N.; Tono, T., 1995.

Purification and properties of polyphenol oxidase from cabbage (Brassica oleracea L.). J. Agric. Food Chem., 43, 11381142. DOI: 0021-8561/95/1443-1138

Fujita, S.; Saari, N.; Maegawa, M.; Tetsuka, T.; Hayashi, N.; Tono, T., 1997.

Isolation and characterization of two phloroglucinol oxidase from cabbage (Brassica oleracea L.). J. Agric. Food Chem., 45, 5963. DOI: S0021-8561(96)00127-6

Fujita, S.; Han, Y-Z.; Kouno, C.; Matsuo, T.; Yamashita, M.; Haraguchi, Y.; Li, Y-J.; Hayashi, N.; Yang, C-P., 2006. Purification and characterization of polyphenol oxidase from edible yam (Dioscorea opposita Thunb.). Food Sci.

Technol. Res., 12, 235239. DOI: 10.3136/fstr.12.23

Gao, Z-J.; Han, X-H.; Xiao, X-G., 2009. Purification and characterizaion of polyphenol oxidase from red Swiss chard (Beta vulgaris subspecies cicla) leaves. Food Chem., 117, 342348. DOI: 10.1016/j.foodchem.2009.04.013 Gawlik-Dziki, U.; Szymanowska, U.; Baraniak, B. 2007. Characterization of

polyphenol oxidase from broccoli (Brassica oleraceae var. botrytis italica) florest. Food Chem., 105, 1047¬1053. DOI: 10.1016/j.foodchem.2007.05.012 Gawlik-Dziki, U.; Złotek, U.; Świeca, M., 2008. Characterization of polyphenol

oxidase from butter lettuce (Lactuca sativa var. capitata L.). Food Chem., 107, 129¬135. DOI: 10.1016/j.foodchem.2007.07.068

Han, Y.-Z.; Ayumu, M.; Eline, N.; Hayashi, N.; Fujita, S., 2006. Purification and characterization of chlorogenic acid oxidase from edible burdock (Arctium

lappa L.). Food Preser. Sci., 32, 275281. DOI:

http://dx.doi.org/10.5891/jafps.32.6_275

Han, Y.; Zhao, F.; Ogawa, T.; Ohta, M.; Fujita, S., 2009. Purification and characterizaion of polyphenol oxidase from Japanese butterbur (Petasies

japonicus). Food Preser. Sci., 35, 179186.

http://agriknowledge.affrc.go.jp/RN/2010780484.pdf

Hartree, E.F., 1972. Determination of protein: a modification of Lowry method that gives a linear photometric response. Anal. Biochem., 48, 422427. DOI:

10.1016/0003-2697(72)90094-2

Jia, G.; Baogang, W.; Xiaoyuan, F.; Haoru, T.; Wensheng, L.; Kaichun, Z., 2011.

Partial properties of polyphenol oxidase in sour cherry (Prunus cerasus L.

CV. CAB) pulp. World J. Agric. Sci., 7, 444449.

http://www.idosi.org/wjas/wjas7(4)/12.pdf

Murata, M.; Kurokami, C.; Homma, S., 1992. Purification and properties of chlorogenic acid oxidase from apple (Malus pumila). Biosci. Biotechnol.

Biochem., 56, 17051710. DOI: 10.1271/bbb.56.1705

Nkya, E.; Kouno, C.; Li, Y. J.; Yang, C,-P.; Hayashi, N; Fujita S. 2003.

Purification and characterization of polyphenol oxidase from garland

polyphenol oxidase from mamey (Pouteria sapota). Phytochemistry.

72,

8288. DOI:

10.1016/j.phytochem.2010.10.011

Rahman, ANF.; Ohta, M; Li, Y.; Nakatani, K.; Hayashi, N.; Fujita, S. 2011, Purification and Characterization of Polyphenol Oxidase from Japanese Radish (Raphanus sativus L.) Root. Food Presevation Scientist. 37, 233-240.

Rahman, ANF.; Ohta, M; Nakatani, K.; Hayashi, N.; Fujita, S. 2012, Purification and Characterization of Polyphenol Oxidase from Cauliflower (Brassica oleracea L.). Journal Agricultural and Food Chemistry. 60, 3673-3678.

Rahman, ANF.; Ohta, M; Nakatani, K.; Hayashi, N.; Fujita, S. 2013, Purification and Characterization of Phloroglucinol Oxidase from Broccoli (Brassica oleracea L. Italica Group). Food Presevation Scientist. 39, 273-282.

Ramírez, E.C.; Whitaker, J.R.; Virador, V.M. Polyphenol oxidase.

2003, Handbook of food enzymology, Marcel dekker, Inc.: Madison avenue, New York.

Soengas, P.; Sotelo, T.; Velasco, P.; Cartea, M.E. 2011, Antioxidant properties of brassica vegeables. Functional sci. and biotechnol. 5, 4355.

Toiguchi, S.; Hayashi, K.; Adachi, Y.; Motoki, M.; Haraguchi, K., 1989.

Purification and characterization of soybean oxidase. Nippon Shokuhin

Kogyo Gakkaishi, 36, 597 602. DOI:

http://dx.doi.org/10.3136/nskkk1962.36.7_597

Wang, J.; Jiang, W.; Wang, B.; Liu, S.; Gong, Z.; Luo, Y., 2007. Partial properties of polyphenol oxidase in mango (Mangifera indica L. CV.

“Tainong”) pulp. J. Food Biochem., 31, 4555. DOI: 10.1111/j.1745-4514.2007.00097.x

Warwick, S.I. 2011, Brassicaceae in agriculture. Genetics and genomics of the

brassicaceae, R. Schmidt, I. Bancraft, Eds.; Springer science:

Canada.

Yang, C.-P.; Fujita, S.; Ashrafuzzaman, Md.; Nakamura, N.; Hayashi, N., 2000.

Purification and characterization of polyphenol oxidase from banana (Musa sapientum L.) pulp. J. Agric. Food Chem., 48, 27322735. DOI:

10.1021/jf991037 +

Yang, C.-P.; Fujita, S.; Kohno, K.; Kusubayashi, A.; Ashrafuzzaman, Md.;

Hayashi, N., 2001. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from banana (Musa sapientum L.) peel. J. Agric. Food Chem., 49,

11461149. DOI:

10.1021/jf001051i

Yoruk, R.; Marshall, M.R., 2003. Physicochemical properties and function of

plant polyphenoloxidase: a review. J. Food Biochem., 27, 361422.

DOI:

10.1111/j.1745-4514.2003.tb00289.x

EAT-06

RANCANG BANGUN ALAT PENGUPAS POKEM UNTUK