BAHAN DAN METODE - Biodegradasi hidrokarbon minyak bumi oleh Bacillus sp. Galur ICBB 7859 dan I

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan dari Februari 2004 sampai Januari 2005 di Laboratorium Biologi Tanah, Departemen Tanah, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri dari ekosistem air hitam Kalimantan Tengah, yaitu Bacillus sp. galur ICBB 7859 dan ICBB 7865 koleksi

Indonesian Center for Biodiversity and Biotechnology (ICBB) (Lampiran 1),

minyak bumi (Sangatta crude oil) dari Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Minyak dan Gas Bumi (PPPTMGB) LEMIGAS Jakarta (Lampiran 2), surfaktan Tween 80, larutan fisiologis, nutrient broth, media minimal (Lampiran 3), KOH, HCl, penolptalin, metil oranye, heksan, toluena, metanol, akuades, pupuk urea dan SP-36 dan contoh tanah pasir.

Alat yang digunakan adalah autoklaf, laminar flow, inkubator, mesin pengocok, vortex, spektrofotometer, spatula, jarum ose, pipet, erlenmeyer, cawan petri, tabung reaksi, pH meter, hot plate, corong pemisah, kertas saring, pinggan porselin, oven, timbangan, toples kedap udara dan bak plastik.

Pelaksanaan Penelitian

Penentuan Kurva Pertumbuhan Bakteri pada Media Nutrient Broth

Kurva pertumbuhan isolat pada media nutrient broth ditentukan dengan mengukur kerapatan optik (620 nm) pada waktu tertentu. Bacillus sp. galur ICBB 7859 dan ICBB 7865 masing-masing diambil 1 ose kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml media nutrient broth dan dilakukan pengocokan. Kerapatan optik diukur pada jam ke: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 dan 48. Hasil pengukuran dibuat kurva dengan sumbu x adalah waktu inkubasi dan sumbu y adalah nilai kerapatan optik.

Penentuan Kurva Standar Populasi Bakteri

Kurva standar populasi menggambarkan hubungan antara nilai kerapatan optik suspensi bakteri (sumbu x) dengan jumlah satuan pembentuk koloni (SPK) bakteri per ml biakan (sumbu y). Kurva ini ditentukan dengan metode turbidimetrik (Gambar 6) (Hadioetomo 1993). Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk menentukan jumlah bakteri sejenis untuk keperluan inokulasi pada suatu percobaan dengan populasi yang seragam.

1 ose

3 ml

3 ml 3 ml 3 ml 3 ml blanko

3 ml nutrient broth

1:1 1:2 1:4 1:8 1:16

kerapatan optik setiap pengenceran diukur 3 ml 100 ml 3 ml nutrient broth 3 ml 3 ml 3 ml kocok 24 jam 3 ml nutrient broth 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 0.5 ml s e r i p e n g e n c e r a n seri pengenceran 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 10-1₁₀-2₁₀-3₁₀-4₁₀-5₁₀-6 4.5 ml garam fisiologis 0.1 ml 0.1 ml nutrient broth agar plate count

Gambar 6 Penetapan kurva standar populasi bakteri.

Uji Aktivitas Bakteri dalam Biodegradasi Hidrokarbon Minyak Bumi di Berbagai Konsentrasi Minyak Bumi pada Media Minimal Cair

Pengujian dilakukan untuk mengetahui kemampuan tumbuh bakteri dan kemampuan biodegradasi di berbagai konsentrasi minyak bumi pada media minimal cair. Bacillus sp. galur ICBB 7859 dan ICBB 7865 ditumbuhkan dalam nutrient broth selama 24 jam dengan pengocokan kemudian diukur kerapatan optiknya. Setelah diketahui jumlah bakteri/ml biakan, kemudian masing-masing isolat diinokulasikan ke dalam 30 ml media minimal cair hingga mencapai kepadatan populasi 1.00 x 106 SPK/ml.

Media minimal cair mengandung 10 000 ppm, 50 000 ppm dan 100 000 ppm minyak bumi. Pengujian dilakukan dengan pengocokan selama 15 hari. Pada akhir inkubasi dilakukan pengukuran pH, kerapatan optik, bobot minyak bumi (total petroleum hydrocarbon/TPH) dan persentase biodegradasi.

Penentuan Kurva Pertumbuhan Bakteri pada Media Minimal Cair

Kurva pertumbuhan bakteri pada media minimal cair ditentukan dengan mengukur kerapatan optik (550 nm) pada waktu tertentu. Bacillus sp. galur ICBB 7859 dan ICBB 7865 ditumbuhkan dalam nutrient broth selama 24 jam dengan pengocokan kemudian diukur kerapatan optiknya. Setelah diketahui jumlah bakteri/ml biakan, kemudian masing-masing isolat diinokulasikan ke dalam 100 ml media minimal cair hingga mencapai kepadatan populasi 1.00 x 106 SPK/ml. Kerapatan optik diukur pada hari ke: 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 dan 15. Selanjutnya dibuat kurva dengan sumbu x adalah waktu inkubasi dan sumbu y adalah nilai kerapatan optik. Selain itu juga dilakukan pengukuran pH media.

Penentuan Kurva Pertumbuhan Bakteri dengan Penambahan Surfaktan pada Media Minimal Cair

Bacillus sp. galur ICBB 7859 dan ICBB 7865 masing-masing diambil 1

ose, ditumbuhkan dalam nutrient broth selama 24 jam dengan pengocokan kemudian diukur kerapatan optiknya. Setelah diketahui jumlah bakteri/ml biakan, kemudian masing-masing isolat diinokulasikan ke dalam 100 ml media minimal cair yang ditambahkan surfaktan Tween 80 pada dosis critical micelle

concentration-nya (0.015 ml/l) hingga mencapai kepadatan populasi 1.00 x 106

SPK/ml. Kerapatan optik diukur pada hari ke: 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 dan 15. Selanjutnya dibuat kurva dengan sumbu x adalah waktu inkubasi dan sumbu y adalah nilai kerapatan optik. Selain itu juga dilakukan pengukuran pH media.

Uji Aktivitas Bakteri dalam Biodegradasi Hidrokarbon Minyak Bumi pada Media Minimal Cair

Pengujian dilakukan berdasarkan rancangan acak lengkap 1 faktor dan 5 kali ulangan. Perlakuan yang diujikan adalah B0 = tanpa inokulasi bakteri, B1 = inokulasi Bacillus sp. galur ICBB 7859 dan B2 = inokulasi Bacillus sp. galur ICBB 7865.

Model linear aditif dari perancangan percobaan sebagai berikut:

Yij = µµ + Bi + εεij

Dimana: Yij nilai pengamatan pada inokulasi bakteri ke-i dan ulangan ke-j, µ merupakan rataan,

sedangkan εij merupakan pengaruh acak pada inokulasi bakteri ke-i ulangan ke-j.

Bacillus sp. galur ICBB 7859 dan ICBB 7865 masing-masing diambil 1

ose, ditumbuhkan dalam nutrient broth selama 24 jam dengan pengocokan kemudian diukur kerapatan optiknya. Setelah diketahui jumlah bakteri/ml biakan,

kemudian masing-masing isolat diinokulasikan ke dalam 100 ml media minimal cair hingga mencapai kepadatan populasi 1.00 x 106 SPK/ml.

Pengujian dilakukan dengan pengocokan selama 15 hari. Pada akhir inkubasi dilakukan pengukuran pH, kerapatan optik, bobot minyak bumi (TPH) dan persentase biodegradasi.

Uji Aktivitas Bakteri dalam Biodegradasi Hidrokarbon Minyak Bumi dengan Penambahan Surfaktan pada Media Minimal Cair

Model linear aditif dari perancangan percobaan sebagai berikut:

Yij = µµ + Bi + εεij

Dimana: Yij nilai pengamatan pada inokulasi bakteri ke-i dan ulangan ke-j, µ merupakan rataan,

sedangkan εij merupakan pengaruh acak pada inokulasi bakteri ke-i ulangan ke-j.

Bacillus sp. galur ICBB 7859 dan ICBB 7865 masing-masing diambil 1

concentration-nya (0.015 ml/l) hingga mencapai kepadatan populasi 1.00 x 106

SPK/ml.

Pengujian dilakukan dengan pengocokan selama 15 hari. Pada akhir inkubasi dilakukan pengukuran pH, kerapatan optik, bobot minyak bumi (TPH) dan persentase biodegradasi.

Uji Aktivitas Bakteri dalam Biodegradasi Hidrokarbon Minyak Bumi dan Penambahan Surfaktan pada Tanah Tercemar Minyak Bumi

Pengujian dilakukan berdasarkan rancangan acak lengkap 2 faktor dan 3 kali ulangan. Untuk faktor yang berpengaruh nyata dilakukan uji lanjut Duncan (Mattjik & Sumertajaya 2002). Kedua faktor tersebut adalah:

1. Faktor bakteri (B) terdiri dari 3 taraf, yaitu: (i) B0 = tanpa inokulasi bakteri, (ii) B1 = inokulasi Bacillus sp. galur ICBB 7859 dan (iii) B2 = inokulasi Bacillus

2. Faktor surfaktan (S) terdiri dari 2 taraf, yaitu: (i) S0 = tanpa penambahan surfaktan dan (ii) S1 = penambahan surfaktan.

Model linear aditif dari perancangan percobaan sebagai berikut:

Yijk = µµ + ái + âj + (áâ)ij + εεijk

Dimana: Yijk nilai pengamatan pada faktor inokulasi bakteri taraf ke-i, faktor surfaktan taraf ke-j dan

ulangan ke-k, µ merupakan rataan, ái pengaruh utama faktor inokulas i bakteri, âj pengaruh utama

faktor s urfaktan, (áâ)ij merupakan komponen interaksi dari faktor inokulasi bakteri dan surfaktan

sedangkan εijk merupakan pengaruh acak yang menyebar normal.

Sebelum diinokulasikan ke media tanah, Bacillus sp. galur ICBB 7859 dan ICBB 7865 ditumbuhkan dalam 250 ml nutrient broth selama 24 jam dengan pengocokan. Kemudian diukur nilai kerapatan optiknya untuk menetapkan jumlah per ml biakan bakteri dengan menggunakan kurva standar. Selanjutnya masing- masing isolat diinokulasikan ke dalam tanah tercemar minyak bumi hingga mencapai kepadatan populasi 1.00 x 106 sel/g tanah. Surfaktan Tween 80 digunakan dengan dosis pada critical micelle concentration-nya (0.015 ml/l) pada kadar air kapasitas lapang.

Media yang digunakan adalah tanah tercemar minyak bumi non-steril sebesar 200 g yang merupakan campuran 180 g BKM tanah dan 20 g minyak bumi (10% b/b). Tanah dikondisikan optimum untuk pertumbuhan bakteri, yaitu dengan mengatur kadar air kapasitas lapang dan memberikan aerasi melalui pengadukan tanah 2 kali seminggu. Selain itu, ditambahkan pupuk urea dan SP- 36 masing-masing 500 kg N dan 50 kg P per 100 ton hidrokarbon minyak bumi (API 1980).

Parameter yang diukur adalah bobot minyak bumi (TPH) dan persentase biodegradasi, CO2-C dan pH tanah pada hari ke: 7, 14, 21 dan 28 inkubasi.

Pengukuran Bobot Minyak Bumi (TPH)

Pengukuran bobot minyak bumi didasarkan pada kelarutannya dalam pengekstrak heksan atau kloroform. Setelah ekstraksi, pelarut diuapkan dan bobot minyak bumi ditentukan secara gravimetri (Greenberg et al. 1992, diacu dalamUdiharto 1996b).

Tahap pengukuran bobot minyak bumi dalam tanah sebagai berikut: - Contoh tanah 5 g + 2.5 ml akuades + 5 ml metanol + 0.15 g KOH + 2.5 ml

toluena.

- Campuran direfluks selama 45 menit kemudian didinginkan dan disaring. Hasil saringan dimasukkan ke dalam corong pemisah.

- Diekstrak dengan n-heksan.

- Dikocok perlahan sampai larutan terpisah menjadi 2 bagian.

- Bagian bawah yang berupa air dikeluarkan sedangkan bagian atas ditampung dalam pinggan porselin.

- Ekstrak dalam pinggan porselin diuapkan dari pelarutnya pada suhu 70 ºC selama 1 jam.

- Disimpan dalam eksikator dan ditimbang sampai bobotnya konstan.

Tahap pengukuran bobot minyak bumi dalam media cair sebagai berikut: - Ditambahkan 10% v/v kloroform ke dalam tabung perlakuan kemudian

dimasukkan ke dalam corong pemisah dan dikocok perlahan selama 15 menit sampai larutan terpisah dua bagian.

- Bagian atas yang berupa air dikeluarkan sedangkan bagian bawah ditampung dalam pinggan porselin.

- Ekstrak dalam pinggan porselin tersebut dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 100 ºC selama 15 menit.

- Disimpan dalam eksikator selama 30 menit kemudian ditimbang sampai bobotnya konstan.

Bobot minyak bumi dihitung dengan menggunakan rumus:

BM = x – y

Dimana: BM = bobot minyak bumi (g), x = bobot pinggan porselin + bobot minyak bumi (g) dan y = bobot pinggan porselin (g).

Total petroleum hydrocarbon (TPH) dihitung dengan menggunakan

rumus:

C BM TPH =

Dimana: TPH =total petroleum hydrocarbon (ppm), BM = bobot minyak bumi (mg atau µl) dan C =

bobot campuran minyak bumi dan media (kg atau l).

Persentase biodegradasi minyak bumi dihitung dengan menggunakan rumus:

(

)

100 % = − × BMo BMn BMo B

Dimana: %B = persen biodegradasi, BMo = bobot minyak bumi awal (g) dan BMn = bobot minyak bumi akhir (g).

Sebelum dilakuan pengukuran bobot minyak bumi pada masing-masing unit percobaan, terlebih dahulu dilakukan penentuan bobot minyak bumi yang

dapat diekstrak dari suatu unit percobaan (Lampiran 4). Pada media minimal cair ditentukan dengan mengukur bobot minyak bumi yang dapat diekstrak dari 1 g minyak bumi yang terkandung dalam 10 ml media minimal cair. Sedangkan pada media tanah ditentukan dengan mengukur 0.5 g minyak bumi yang terkandung dalam 5 g campuran minyak bumi dan tanah. Selanjutnya persentase minyak bumi yang dapat diekstrak dijadikan faktor pengali untuk bobot minyak bumi yang didapatkan dari masing-masing unit percobaan.

Pengukuran pH Tanah

Pengukuran pH tanah bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghasilkan metabolit berupa asam.

Sebanyak 10 g tanah ditambahkan akuades dengan perbandingan 1:1 kemudian dikocok selama 30 menit. Selanjutnya pH tanah diukur dengan menggunakan pH meter.

Pengukuran CO2-C

Pengukuran CO2-C bertujuan untuk mengetahui tingkat aktivitas bakteri dalam menurunkan bobot minyak bumi.

Tanah dimasukkan ke dalam toples kemudian diberi 2 tabung film berisi 5 ml 0.2 N KOH dan 10 ml air dan ditutup sampai kedap udara. Selanjutnya diinkubasi selama 3 hari pada hari ke: 7, 14, 21 dan 28 pada suhu ruang di tempat gelap. Hal yang sama dilakukan pada kontrol, yaitu toples tanpa tanah. Pada akhir inkubasi ditambahkan 2 tetes penolptalin ke dalam tabung film KOH kemudian dititrasi dengan HCl sampai warna merah hilang dan dicatat volume HCl yang diperlukan. Selanjutnya ditambahkan 2 tetes metil oranye dan dititrasi lagi dengan HCl sampai warna kuning berubah menjadi pink lalu volume HCl yang diperlukan dicatat.

Menurut Anas (1989) jumlah CO2-C yang dihasilkan per kg tanah lembab per hari dihitung dengan rumus:

(

)

n BKM t b a r 1000 12× × × − =

Dimana: a = HCl contoh tanah (ml), b = HCl kontrol (ml), t = normalitas HCl (N), n = jumlah hari inkubasi dan BKM = bobot kering tanah (g).

Dalam dokumen Biodegradasi hidrokarbon minyak bumi oleh Bacillus sp. Galur ICBB 7859 dan ICBB 7865 dari ekosistem air hitam Kalimantan Tengah dengan penambahan surfaktan (Halaman 40-47)