Tempat dan Waktu
Ovarium diperoleh dari Rumah Potong Hewan Kambing/Domba, Kampung Cikanyong Desa Citaringgul, Kecamatan Babakan Madang, Kabupaten Bogor. Penelitian dilakukan di Laboratorium Fertilisasi In Vitro, Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor pada bulan Februari hingga Agustus 2011.
Metode Penelitian
I. Tingkat Maturasi Inti Oosit Domba pada Berbagai Suhu dan Waktu Penyimpanan
Transportasi Ovarium dari RPH Menuju Laboratorium FIV
Ovarium domba di koleksi dari rumah potong hewan dan ditempatkan di dalam larutan 0,9% NaCl yang ditambahkan dengan 0,06 g/l penicillin dan 0,1 g/l streptomicyn . Ovarium yang diperoleh dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan dengan suhu medium penyimpanan yaitu suhu 27-28°C, 36-37°C dan 4°C.
Gambar 1 . Metode transportasi ovarium dari rumah potong hewan. A: Ovarium didalam larutan NaCL, B: Termos untuk membawa ovarium pada suhu 36-37°C, C: Tas untuk membawa ovarium dalam suhu 4°C
Kelompok ovarium dengan suhu 27-28°C dibawa dengan menempatkan ovarium didalam plastik yang berisi cairan NaCl fisiologis dan dibawa ke laboratorium. Kelompok ovarium dengan suhu 36-37°C ovarium ditempatkan di dalam plastik yang berisi NaCl fisiologis dan dimasukkan kedalam termos yang diberi air dengan suhu 37°C. Kelompok ovarium dengan suhu 4°C dibawa dengan menempatkan ovarium didalam plastik yang berisi NaCl fisiologis dan kemudian menempatkannya didalam termos yang diberi ice gel didalamnya. Metode dan alat
yang digunakan untuk membawa ovarium dari RPH ke laboratorium seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Setelah tiba di laboratorium, oosit dikoleksi masing- masing dari ketiga kelompok suhu penyimpanan pada 2-4 jam setelah pemotongan hewan. Prosedur yang sama juga dilakukan untuk kelompok penyimpanan selanjutnya yaitu oosit dikoleksi setelah 5-7 jam dan 8-10 jam setelah pemotongan. Penentuan 0 jam didefinisikan berdasarkan waktu awal pemotongan hewan di RPH. Koleksi dan Pematangan Oosit In Vitro
Koleksi oosit dilakukan dengan metode pencacahan (slicing) menggunakan pisau bedah steril dan oosit diseleksi berdasarkan keadaan sitoplasma yang homogen dan sel-sel kumulus yang kompak. Hasil koleksi oosit dikategorikan dalam 4 kelompok berdasarkan kualitas sitoplasma dan sel-sel kumulus. Penelitian ini hanya menggunakan oosit dengan kualitas yang baik seperti yang ditunjukkan pada gambar 2A.
Gambar 2. Oosit dengan kualitas yang baik (A), oosit dengan kualitas yang tidak baik (B)
Oosit dikoleksi di dalam medium Phosphate Buffered Saline (PBS) ditambah
0,3% Bovine Serum Albumin (BSA) (Sigma, F-7524) dan penicillin-strepromycin
100 IU/ml. Oosit hasil koleksi dicuci dalam medium maturasi sebanyak dua kali dan selanjutnya dimaturasi dalam Tissue Culture Medium (TMC) 199 (Sigma, USA) ditambahkan 5% FBS, 2 IU/ml Pregnant Mare Serum Gonadotrophin (PMSG) (Intergonan, Intervet Deutschland GmbH), 2 IU/ml human Chorionic Gonadotrophin (hCG) (chorulon, intervet international B.V. Boxmeer-Holland), dan 10 µg/ml gentamycin (Sigma, G-1264). Oosit diletakkan ke dalam drop dari medium maturasi masing-masing 100 µl untuk 10-15 oosit dan ditutup dengan
B A
mineral oil (Sigma-Aldrich. Inc, M-8410) kemudian dimaturasi dalam inkubator 5% CO2, temperatur 38,5o C selama 28 jam.
Pembuatan Preparat Fiksasi Oosit
Oosit yang telah dimaturasi dicuci dan dihilangkan semua bagian sel kumulus dengan bantuan 0,25% enzim hyaluronidase dengan cara dipipet berulang-ulang menggunakan pipet yang disesuaikan dengan ukuran oosit. Kemudian oosit diletakkan pada drop 0,7% KCl diatas gelas objek yang sebelumnya telah direndam dalam alkohol, lalu difiksir dengan cara ditutup dengan cover glass yang memiliki
bantalan paraffin dan vaselin (1:9) pada kedua sisinya. Preparat tersebut
dimasukkan dalam larutan fiksasi yang mengandung asam asetat dan ethanol (1:3) selama 3 hari.
Evaluasi Pematangan Inti Oosit
Preparat yang telah difiksasi selama 3 hari selanjutnya diwarnai dengan pewarna 2 % aceto-orcein selama ±5 menit. Kemudian zat pewarna dibersihkan dengan 25 % asam asetat dan keempat sisi cover glass diberi larutan kuteks bening untuk selanjutnya dilakukan pengamatan morfologi dengan mikroskop fase kontras (Olympus IX 70, Japan).
Evaluasi tingkat kematangan inti dinilai dengan cara menghitung jumlah oosit pada setiap tahap pembelahan meiosis. Status inti oosit dikelompokkan menjadi tahap germinal vesicle (GV), germinal vesicle break down (GVBD), metaphase I (MI), anaphase I- telophase I (AI-TI) dan metaphase II (MII). Tahap GV ditandai dengan membran inti yang masih menyatu dengan vesicle, GVBD ditandai dengan robeknya membran inti dan inti sudah tidak terlihat jelas, sedangkan MI ditandai dengan adanya kromosom homolog yang berderet di bidang ekuator serta MII ditandai dengan adanya badan kutub I dan susunan kromosom yang sama dengan tahap MI. Oosit dikategorikan sebagai oosit yang telah matur jika telah berada pada tahap Metaphase II.
II. Tingkat Fertilisasi In Vitro (IVF) Oosit Domba pada Berbagai Suhu dan Waktu Penyimpanan
Kompetensi oosit domba yang dikoleksi dari ovarium yang disimpan pada suhu dan waktu penyimpanan yang berbeda diuji hingga tahap fertilisasi in vitro.
Fertilisasi dilakukan terhadap oosit yang dikoleksi dari setiap kelompok perlakuan penyimpanan ovarium pada suhu dan waktu penyimpanan yang berbeda. Tahap fertilisasi dilakukan pada oosit yang berasal dari setiap kelompok perlakuan setelah sebelumnya dimaturasi. Tahap proses maturasi oosit dilakukan mengikuti prosedur yang sama seperti pada penelitian tahap pertama.
Penyiapan Spermatozoa
Fertilisasi in vitro menggunakan semen beku domba garut yang berasal dari
satu individu yang sama pada setiap kali IVF. Proses thawing dilakukan dengan menempatkan semen beku domba dalam air bersuhu 37°C selama 30 detik. Selanjutnya semen disentrifugasi dengan 1600 rpm selama 5 menit dalam medium fertilisasi. Setelah disentrifugasi, supernatan dibuang kemudian dilakukan penghitungan konsentrasi sperma. Tahap selanjutnya adalah menambahkan medium fertilisasi hingga mencapai konsentrasi spermatozoa yang digunakan untuk keperluan IVF yaitu sebesar 5.106 spermatozoa/ml.
Fertilisasi In Vitro
Spermatozoa yang telah disiapkan kemudian ditempatkan dalam bentuk drop masing-masing sebanyak 100 µl pada cawan petri. Kemudian persiapan juga dilakukan pada oosit yang akan difertilisasi. Oosit yang telah dimaturasi selama 24 jam kemudian dicuci dalam medium fertilisasi sebanyak dua kali. Oosit kemudian dipindahkan ke dalam drop spermatozoa, masing-masing drop untuk 10-15 oosit
dan kemudian diinkubasi selama 14 jam dalam inkubator CO2 5%, 38,5°C.
Evaluasi Tingkat Fertilisasi In Vitro
Pengamatan tingkat fertilisasi dilakukan dengan membuat preparat oosit seperti pada penelitian tahap maturasi oosit. Tingkat fertilisasi diamati dengan melihat terjadinya pembentukan pronukleus (PN). Oosit yang telah mengalami fertilisasi ditandai dengan terbentuknya dua pronukleus (jantan dan betina, 2 PN) atau lebih (>2 PN) dalam sitoplasma oosit. Tingkat fertilisasi merupakan perbandingan antara jumlah sel telur yang dibuahi (membentuk dua atau lebih pronukleus) dengan jumlah keseluruhan sel telur yang difertilisasi.
Analisis Data
Penelitian ini dirancang dengan rancangan acak lengkap (RAL) faktorial. Tingkat maturasi inti oosit pada masing-masing perlakuan diulang sebanyak 5 kali, sedangkan perlakuan pada tingkat fertilisasi diulang sebanyak 4 kali. Data status inti oosit yaitu tahap GV, GVBD, MI, A/T dan MII yang diperoleh dianalisis dengan analysis of variance (ANOVA) dan dilanjutkan dengan uji Duncan. Begitu pula dengan data tingkat fertilisasi yang didapatkan yaitu jumlah oosit dengan status 1 PN, 2 PN dan >2PN yang diperoleh juga dianalisis dengan ANOVA dan kemudian diuji lanjut dengan uji Duncan (Steel & Torrie, 1993).