3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret-Agustus 2011, di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA, Laboratorium Biologi Tanah dan Rumah Kaca Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara. Penelitian ini dilakukan dengan tahapan : 1. Isolasi Rhizobium dari tanaman kacang kedelai (Glycine max (L.) Merrill)
pada tanah gambut dan tanah mineral.
2. Uji efektivitas isolat Rhizobium dari tanah gambut dan tanah mineral.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah tanah gambut yang diambil dari Desa Paya Pinang Tebing Tinggi dan isolat kedelai yang diisolasi dari tanah mineral. Aquades, alkohol 96%, benih kedelai varietas Anjasmoro, Kongo red, Na-hipoklorit, larutan NaCl, yeast Ekstrak Manitol Broth (YMB), Brom Thymol Blue, Etanol 100 ml, Media Yeast Ekstrak Manitol Agar (YEMA) dengan komposisi K2HPO4 0,5 g; MgSO47H2O 0,2 g; NaCl 0,1 g; Mannitol 10 g; Yeast cair 100 ml, Agar, 1 L aquades. Alat yang digunakan : oven, autoklaf, botol vial, mikroskop, tabung reaksi, pengaduk, jarum ose, cawan petri, kertas label, kamera, gelas ukur, Mikroskop, Erlenmeyer, polybag, cangkul, timbangan dan peralatan Laboratorium lainnya.
3.3 Pengambilan sampel Tanah Gambut
Sampel tanah gambut diambil di daerah Tebing Tinggi Kebun Paya Pinang. Tingkat kematangan gambut tersebut adalah hemik. Pengambilan sampel dilakukan dengan metode komposit. Tanah gambut diambil secara acak pada beberapa titik sebanyak 5 kg pada kedalaman 0-20 cm, kemudian tanah dimasukkan kedalam kantong plastik dan diikat serta diberi label. Untuk mengisolasi Rhizobium dari tanah gambut, tanah tersebut ditanami kedelai untuk memperoleh bintil akar. Trapping dilakukan di lahan terbuka di Desa Marendal, Deli Tua sampai tanaman kedelai berumur 42 hari. Kemudian bintil akar kedelai diisolasi, sedangkan untuk isolat pembanding diisolasi dari bintil akar kedelai asal tanah mineral yang diambil di daerah penanaman kedelai di Lubuk Pakam yang mempunyai pH 6,8.
3.4 Isolasi Bintil Akar Kedelai dari Tanah Gambut dan Tanah Mineral
Bintil akar kedelai diambil dari perakaran kedelai yang ditanam pada tanah gambut dan tanah mineral. Sterilisasi bintil akar tanaman kedelai (Glycine max (L.) Merrill) dilakukan dengan cara membersihkan bintil akar dengan air mengalir untuk menghilangkan tanah yang menempel dipermukaannya lalu direndam alkohol 96% selama 10 detik lalu direndam dengan Na-hipoklorit selama 3 menit dan dibilas dengan aquades steril sebanyak 3 sampai 4 kali bilas. Bintil akar steril diletakkan di cawan porselin lalu dipecah atau digerus dan ditambahkan dengan 1 ml larutan fisiologis. Suspensi lalu diambil 1 ose dan digoreskan pada media YEMA yang mengandung merah kongo yaitu 0,25 g merah kongo dicampur dengan 100 ml air lalu diambil 10 ml larutan stok merah kongo. Koloni Rhizobium yang tumbuh diamati, koloni yang tidak menyerap atau hanya sedikit menyerap warna merah kongo berarti bakteri tersebut bakteri Rhizobium.
Koloni bakteri Rhizobium kemudian ditumbuhkan kembali ke dalam media YEMA yang mengandung Brom Thymol Blue yaitu 0,5 g BTB dilarutkan di dalam 100 ml etanol lalu diambil 5 ml larutan stok BTB. Brom thymol blue berfungsi untuk mengetahui apakah Rhizobium tersebut termasuk golongan
Rhizobium atau Bradyrhizobium, apabila isolat Rhizobium tumbuh cepat dan media berubah menjadi warna kuning maka tergolong Rhizobium sedangkan bila berwarna biru dan bakteri tumbuh lambat maka digolongkan menjadi Bradyrhizobium. Isolat yang tumbuh pada media YEMA + Brom Thymol Blue dikarakteristik berdasarkan morfologinya.
3.5 Seleksi Isolat Bradyrhizobium dari Tanah Gambut
Pembuatan kultur cair Bradyrhizobium dilakukan dengan mengambil 1-2 ose isolat Bradyrhizobium lalu dicampurkan ke dalam 20 ml Yeast Manitol Broth (YMB) dalam Erlenmeyer, lalu dishaker selama 9 hari pada temperatur kamar. Hasil subkultur biakan bakteri diambil 1 ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 10 ml akuades steril. Setelah dihomogenkan dengan cara divortex dan disamakan kekeruhannya dengan standar Mac Farland sehingga diperoleh suspensi bakteri dengan kerapatan sel 108 CFU/ml. Isolat yang diperoleh dari hasil isolasi selanjutnya diseleksi untuk memperoleh isolat Bradyrhizobium japonicum yang efektif. Seleksi isolat Bradyrhizobium dilakukan pada media tanah gambut yang sudah disterilisasi selama 3 jam. Tanah gambut yang sudah steril dimasukkan ke dalam polybag sebanyak 2 kg/polybag. Kemudian benih kedelai varietas Anjasmoro ditanam ke dalam polybag masing-masing 3 benih kedelai tiap lubang tanam. Pada hari ke-7 tanaman diseleksi dan hanya dua tanaman yang tumbuh baik yang dipelihara. Inokulasi benih kedelai dilakukan dengan pemberian 1 ml suspensi bakteri Bradyrhizobium japonicum dengan kerapatan sel 108
3.6 Uji Efektivitas dari Isolat Rhizobium
CFU/ml. Pengamatan isolat Bradyrhizobium japonicum yang efektif diamati berdasarkan bobot kering tanaman kedelai yang dipanen pada umur 42 hari setelah tanam. Setelah diperoleh satu isolat Bradyhizobium yang menghasilkan bobot kering tanaman tertinggi selanjutnya dilakukan uji efektivitas.
Tanah gambut yang akan digunakan sebagai media tumbuh disterilkan ke dalam dandang selama 3 jam. Tanah gambut yang steril tersebut dimasukkan ke
dalam polybag sebanyak 2 kg/polybag dan diberikan pupuk dasar yaitu pupuk KCl (60% K2O, 45% Cl) dan TSP (46-48% P2O5, 2% S, 20% CaO). Sebelum benih kedelai ditanam, benih kedelai varietas Anjasmoro diinokulasi dengan inokulan Bradyrhizobium japonicum sebanyak 1 ml dengan kerapatan sel 108 CFU/ml (menggunakan standart Mac Farland). Benih kedelai didiamkan selama beberapa menit kemudian ditanam ke media tanam (polybag) yang berisi tanah gambut steril. Sedangkan pada tanaman kontrol tanpa inokulasi dengan pemberian pupuk N yaitu dengan pemberian pupuk urea. Masing-masing polybag berisi 3 benih dan polybag disusun dirumah kaca. Penyulaman dilakukan pada umur ± 1 minggu setelah tanam untuk mendapatkan kedelai yang seragam. Penyiraman dilakukan pada pagi dan sore hari. Tanaman dipanen pada umur 42 hari setelah tanam.
3.7 Variabel Pengamatan
Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah bobot kering tanaman
yaitu tanaman dipotong pada leher akar dekat permukaan tanah atau mulai sisa kotiledon pertama, kemudian dibersihkan dan dimasukkan dalam kantong kertas lalu dikeringkan dalam oven pada suhu 70o
ES = ���������������������������������
���������������������������������� x 100%
C selama 48 jam kemudian dimasukkan desikator selama 15 menit lalu ditimbang. Bobot kering akar yaitu akar tanaman dicuci bersih dengan air dan diovenkan sama halnya dengan bobot kering tajuk tanaman. Jumlah bintil akar, jumlah bintil akar yang terbentuk pada akar tanaman kedelai dihitung untuk masing-masing perlakuan. Bobot kering bintil akar yang terbentuk pada akar tanaman kedelai dihitung untuk masing-masing perlakuan dengan menggunakan neraca analitik. Efektivitas Simbiosis dapat dihitung berdasarkan rumus :
3.8 Pengukuran Kandungan Nitrogen dan Serapan Nitrogen Tanaman Kedelai (Glycine max (L.) Merrill)
Bagian tanaman dikeringkan dalam oven pada suhu 70o
% N = ��−������,�����
������ (�)
x 100%
C selama 48 jam. Kandungan N tanaman dianalisis menggunakan metode Kjeldahl, dapat ditentukan dengan rumus :
Dengan, V2 V
= volume titrasi sampel
1
F = faktor konversi/perkalian = 6,25 = volume titrasi blanko
Prosedur percobaan metode Kjeldahl adalah sebagai berikut :
Tahap destruksi yaitu sampel ditimbang 2 gram dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi disertai blanko. Penetapan kadar air dilakukan untuk mengoreksi bobot kering sampel pada suhu 105 oC, kemudian sampel dan blanko ditambah 0,5 gram campuran selenium 2,5 ml H2SO4 pekat. Sampel dipanaskan diatas penangas listrik khusus untuk ukuran tabung reaksi, mula-mula pada suhu rendah, perlahan-lahan suhu dinaikkan sampai suhu 360 o
Tahap destilasi suspensi sampel dimasukkan kedalam tabung destilasi secara kuantitatif sambil dibilas dengan air destilasi secukupnya kemudian diletakkan pada alat destilasi. Alat tersebut secara otomatis akan menambahkan 10 ml larutan NaOH 50% kedalam tabung destilasi. Destilat kemudian ditampung dengan menggunakan Erlenmeyer 250 ml yang berisi 5 ml asam boraks dan larutan indikator campuran. Destilasi dilakukan selama 3 menit. Tahap titrasi yaitu destilat hasil destilasi tersebut dititrasi dengan HCl 0,01 N hingga larutan menjadi merah jambu. Penetapan blanko juga dilakukan pada tahap titrasi tersebut.
C, setelah suspensi berwarna putih, tabung kemudian diangkat dan didinginkan.
Untuk menghitung serapan nitrogen dari tanaman kedelai, dapat ditentukan dengan rumus :
3.9 Analisis Data
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan 6 perlakuan dengan tiga ulangan pada uji seleksi dan pada uji efektifitas terdiri dari 4 perlakuan dengan 5 ulangan. 4 perlakuan pada uji efektivitas terdiri atas : kontrol tanpa inokulasi dan tanpa pupuk N (K-N), kontrol tanpa inokulasi dengan pemberian pupuk N (K+N), inokulasi tanaman kedelai dengan inokulan B. japonicum asal tanah gambut (BJG), dan inokulasi tanaman kedelai dengan inokulan B. japonicum asal tanah mineral (BJM).
Adapun model rancangan acak lengkap adalah :
Yij = µ + Ti +
ε
Dimana :
ij
Yij = Respon Pengamatan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = Nilai tengah umum
Ti = Pengaruh perlakuan ke-i
ε
ij = Pengaruh Galat percobaan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j. Apabila terdapat perbedaan nyata dilanjutkan dengan Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) dengan cara :BNTa = ta (db galat) x �2�2
�
BAB IV