FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Oktober 2010 hingga Maret 2011 di Labo-ratorium Bagian Mikrobiologi Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah isolat-isolat terbaik dari bakteri yang berasosiasi dengan spons hasil penelitian terdahulu yaitu SAB 8, SAB 32, SAB 33, SAB 35, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 (Abubakar 2009). Mikrob indikator yang digunakan untuk uji antagonis adalah E. coli, B. subtilis, EPEC, S. aureus, P. aureus, C. albicans dan C. tropicalis. Media yang digunakan yaitu SWC (Sea Water Complex), NB (Nutrient Broth), NA (Nutrient Agar), PDB (Potato Dextrose Broth) dan PDA (Potato Dextrose Agar). Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah n-butanol. Untuk isolasi genom digunakan bahan Tris-EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acid), lisozim, SDS (Sodium dodecyl sulfate), proteinase K, NaCl 5M, CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide), PCI (Phenol Chloroform Isoamylalchohol), CI (Chloroform Isoamyl-alchohol), sodium asetat, etanol absolut, etanol 70% dan aqua bidestilata. Untuk PCR (Polymerase Chain Reaction) digunakan buffer, Kit-PCR (TAKARA La Taq), primer spesifik (for-ward dan reverse), Alat-alat labora-torium yang digunakan adalah vorteks, laminar (Jouan, Perancis), autoklaf, hot plate, mikroskop, pipet mikro, cawan, tabung, serta peralatan umum yang digunakan di laboratorium. Metode
Ekstraksi senyawa bioaktif menggu-nakan n-butanol. Isolat SAB dikulturkan ke
dalam 500 ml media SWC cair. Kultur diinkubasi pada shaker (100 rpm, 30 ºC) selama tiga hari. Setelah itu kultur ditambah-kan 150 ml n-butanol dan diin-kubasi pada suhu 40 ºC selama 24 jam, distirer selama 20 menit, dan dievaporasi. Ekstrak yang dihasil-kan disimpan pada suhu 5 ºC untuk pemakai-an selpemakai-anjutnya (Muller et al. 2004).
Bioassay ekstrak kasar senyawa antimikrob. Mikrob indikator dikultur selama 24 jam. Sebanyak 1% kultur mikrob indikator dicampurkan ke media NA dan PDA semi padat lalu dituangkan di cawan. Ekstrak kasar senyawa antimikrob yang telah dilarutkan dengan etil asetat (100 mg/ml) diteteskan ke kertas cakram masing-masing sebanyak 100 µ l kemudian diletakkan di permukaan media agar semipadat tersebut. Cawan uji diinkubasi selama 24 jam. Hasil uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening.
Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Isolat bakteri SAB dikulturkan dalam medium SWC lalu diinkubasi selama tiga hari di suhu ruang. Mikrob target diremajakan kembali dalam media NB untuk E. coli, EPEC, S. aureus, B. subtilis, dan P. aeruginosa atau dalam media PDB untuk C. albicans dan C. tropicalis. Mikrob target tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.
Isolat bakteri SAB penghasil antimikrob yang telah diinkubasi kemudian disentri-fugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 30 menit. Filtrat dari hasil sentrifugasi dimasukkan kedalam 5 tabung reaksi dengan konsentrasi yang berbeda-beda masing-masing 6.25%, 12.5%, 25%, 50%, dan 100%. Selain kelima konsentrasi tersebut, dibuat juga kontrol yang tidak diberi filtrat bakteri. Setelah itu, masing-masing tabung diisi dengan 1 ml bakteri target. Biakan uji MIC tersebut lalu diinkubasi selama 24 jam. Kemudian diamati kekeruhan masing-masing biakan di dalam tabung reaksi dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. MIC ditentukan berdasar-kan kekeruhan biaberdasar-kan dibandingberdasar-kan dengan kontrol.
Isolasi Genom. Isolat bakteri dikultur-kan dalam media kaldu SWC selama 24 jam. Sebanyak 1.5 ml kultur disentrifugasi 10 000 rpm selama 10 menit. DNA genom bakteri diekstrak dengan mengikuti metode CTAB (Sambrook & Russell 2001).
Deteksi Gen Penyandi PKS dan NRPS dengan PCR. Reaksi PCR untuk meng-amplifikasi gen penyandi PKS dan NRPS dilakukan dengan mengikuti metode Schirmer et al. (2005). Reaksi PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dengan masing-masing tahap yaitu predenaturasi selama 1 menit dan denaturasi selama 30 detik pada suhu 94 ºC, annealing 50 ºC selama 30 detik, polimerisasi 75 ºC selama 1 menit 10 detik, dan post PCR dilakukan pada suhu 72 ºC selama 5 menit. Visualisasi amplikon PKS dan NRPS dilakukan melalui elektroforesis. Isolat yang mempunyai gen penyandi domain keto-sintase (KS) dari PKS menunjukkan terbentuknya pita pada ukuran di sekitar 700 pasang basa (basa pair) (Gambar 3), sedangkan pada deteksi gen penyandi domain adenilase (A) dari NRPS ditunjuk-kan dengan munculnya pita di sekitar ukuran 1 000 bp.
Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan PCR. Amplifikasi gen ini dilakukan terhadap isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik. Amplifikasi gen dilaku-kan dengan mencampurkan 12.5 bufer PCR GC II, 4 µ l dNTPs (2.5 mM/dNTP), 1 µl primer 63 f (CAGGCCTAACACATGC-AAGTC), 1 µl primer 1387 r (GGGCGGWGTGTACAA-GGC), 4 µ l DNA cetakan, dan 0.25 µ l Taq DNA polymerase (TAKARA) dan 2.25 µ l ddH2O. Ampli-fikasi dilakukan dalam mesin PCR (Perkin-Elmer, USA) sebanyak 30 siklus. Tahap amplifikasi yang diatur yaitu predenaturasi 5 menit dan denaturasi 1 menit pada suhu 94 ºC, annealing 1 menit pada suhu 55 ºC, serta polimerisasi 1 menit dan post PCR 2 menit pada suhu 72 ºC. Visualisasi amplikon 16S rRNA dilakukan melalui elektroforesis. Hasil amplifikasi gen PCR ini kemudian disekuen di 1st BASE PTE Ltd, Singapura.
Analisis Sekuen 16S rRNA. Sekuen DNA bakteri dianalisis untuk mengidentifikasi bakteri SAB. Identifikasi spesies dilakukan dengan analisis homologi sekuen mengguna-kan program Blast-N dari situs NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Setelah dike-tahui spesies bakteri SAB selanjutnya
dianalisis kekerabatannya dengan membuat pohon filogenetik. Sekuen gen 16S rRNA disejajarkan dengan menggunakan program clustal W (www.ebi.ac.uk/clustalw/). Pohon filogene-tik dikonstruksi dengan program Treecon 1,3b (Peer & Watcher 1994).
Uji Fisiologis dan Uji Gram. Isolat diremajakan ke media agar miring selama 24 jam. Pada uji fisiologis, seluruh isolat yang tumbuh di agar miring dipindahkan ke dalam larutan garam fisiologis 10 ml kemudian divorteks hingga larut dan larutan garam fisiologis mencapai kekeruhan 80%. Setelah itu, uji fisiologis dilakukan dengan menetes-kan larutan bakteri uji masing-masing 200 µ l ke dalam kit uji (Microgen GN-ID A-B Panel). Reaksi fisiologis yang diuji yaitu lisin, ornitin, H2S, glukosa, manitol, xilosa, ONPG, indol, urease, Voges Proskauer, sitrat, TDA, gelatin, malonat, inositol, sorbitol, ramnosa, sukrosa, laktosa, arabinosa, adonitol, rafinosa, salicin, arginin, nitrat dan oksidase. Motilitas bakteri diamati dengan pengamatan miroskop. Uji Gram dilakukan dengan metode pewarna-an Gram stpewarna-andar.
HASIL
Bioassay Ekstrak Kasar Senyawa Antimikrob. Ekstraksi menghasilkan ekstrak kasar senyawa antimikrob. Ekstrak tersebut diuji aktivitasnya terhadap beberapa mikrob indikator dan sebagian besar menghasilkan aktivitas antimikrob terhadap mikrob indikator (Tabel 2). Aktivitas senyawa bioaktif antimikrob ditunjukkan dengan adanya zona bening (Gambar 1). Sehingga kontrol negatif yang tidak memiliki aktivitas antimikrob tidak akan membentuk zona bening dan kontrol positif (ampisilin) akan menghasilkan zona bening (Gambar 2). Hasil bioassay menunjukkan bahwa semua ekstrak kasar senyawa antimikrob mempunyai aktivitas positif terhadap E. coli, EPEC, B. subtilis, dan P. aeruginosa. Ekstrak kasar terbaik yang mempunyai spektrum aktifitas terhadap semua mikrob uji adalah isolat SAB E-35.
Tabel 2 Hasil uji antimikrob ekstrak kasar SAB terhadap mikrob indikator.
No. Kode Isolat
Hasil Uji Antimikrob
E. coli B. subtilis *EPEC * S. aureus * P. aeruginosa * C. albicans * C. tropicalis 1 SAB E-8 + + ++ - + + - 2 SAB E-32 + + + - + - - 3 SAB E-33 + + + - + - - 4 SAB E-35 +++ + ++ ++ +++ + + 5 SAB E-37 + + ++ - + - - 6 SAB E-38 + + + - + - - 7 SAB E-40 ++ + + - + - - 8 SAB S-43 ++ ++ ++ + +++ - -
Keterangan: + :ukuran zona hambat 0.5-5 mm; ++ :5.1-10 mm; +++ : 10.1-15 mm; *: patogen.
Gambar 1 Hasil uji aktivitas ekstrak antimikrob SAB E-8 (a), SAB E-32 (b), SAB E-33 (c), SAB E-37 (d), SAB E-38 (e), SAB E-40 (f), dan SAB E-43 (g) terhadap Bacillus subtilis.
(a) (b)
Gambar 2 Hasil uji aktivitas antimikrob terhadap B. subtilis pada (a) ekstrak SAB E-35, kontrol negatif, dan (b) kontrol positif.
Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Hasil uji MIC menunjukkan kosentrasi minimum penghambatan yang berbeda-beda pada setiap isolat (Tabel 3). Nilai maksimum penghambatan terbaik ditunjukkan pada persentase terkecil yaitu 6.25%. Berdasarkan uji MIC, semua isolat potensial hanya dapat menghambat per-tumbuhan mikrob target atau bakteriostatik.
Deteksi Gen Penyandi PKS dan NRPS dengan PCR. Hasil deteksi gen penyandi PKS dan NRPS menunjukkan bahwa semua isolat SAB yang diteliti mempunyai kedua gen tersebut (Gambar 3 dan 4). Isolat terbaik, SAB E-35, kembali menunjukkan konsistensi-nya dengan menunjukkan adakonsistensi-nya gen PKS dan NRPS.
g
f
e
d
c
b
a
Tabel 3 Hasil Uji MIC isolat bakteri SAB terhadap beberapa mikrob indikator. Mikrob Uji MIC (%) SAB E-8 SAB E-32 SAB E-33 SAB E-35 SAB E-37 SAB E-38 SAB E-40 SAB S-43 E. coli 6.25% 6.25% 6.25% 12.5% 100% 100% 25% 12.5% EPEC 100% 50% 25% 100% 100% 100% 12.5% 50% S. aureus 100% 50% 100% 100% 100% 100% 100% 100% P. aeruginosa 6.25% 25% 6.25% 50% 6.25% 100% 6.25% 50% B. subtilis 12.5% 25% 12.5% 6.25% 100% 25% 100% 100% C. albicans 100% 100% 6.25% 6.25% 100% 100% 50% 100% C. tropicalis 100% 100% 100% 6.25% 50% 50% 50% 100% Bs/Fs Bs/Fs Bs/Fs Bs/Fs Bs/Fs Bs/Fs Bs/Fs Bs/Fs
Keterangan: Bs: Bakteriostatik, Fs: Fungistatik.
Gambar 3 Hasil visualisasi PCR gen PKS menunjukkan (berurutan dari kiri ke kanan) isolat SAB E-8, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 mempunyai domain gen PKS.
Gambar 4 Hasil visualisasi PCR gen NRPS juga menunjukkan (berurutan dari kiri ke kanan) isolat SAB E-8, SAB E-32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 mempunyai domain gen NRPS.
700 bp 8 32 33 35 37 38 40 43 M 8 32 33 35 37 38 40 43 M 1000 bp 10 000 bp 1 000 bp 500 bp 10 000 bp 1 000 bp 500 bp
Analisis Sekuen 16S rRNA. Isolat dengan aktivitas terbaik (SAB E-35) dilakukan identifikasi dengan analisis homologi sekuen 16S rRNA. Hasil analisis menunjukkan bahwa SAB E-35 memiliki kemiripan terbesar dengan genus Providencia, terutama spesies P. vermicola dengan identitas maksimum sebesar 99% dan nilai E sama dengan 0.
Uji Fisiologis dan Uji Gram. Hasil uji fisiologis SAB E-35 ditunjukkan pada Tabel 4. Reaksi positif menunjukkan bahwa bakteri melakukan reaksi yang melibatkan atau menghasilkan senyawa-senyawa yang diuji. Hasil tersebut menunjukkan bahwa SAB E-35 merupakan bakteri motil yang dapat melakukan reaksi oksidasi. Beberapa reaksi fisiologis lain memperlihatkan hasil yang berbeda-beda. Hasil pengamatan uji Gram menunjukkan sel bakteri berwarna merah sehingga diketahui SAB E-35 merupakan bakteri gram negatif dan berbentuk basil (Gambar 5).
Analisis Pohon Filogenetik. Konstruksi pohon filogenetik menunjukkan bahwa isolat SAB E-35 mempunyai kekerabatan yang dekat dengan beberapa bakteri laut penghasil senyawa bioaktif (Gambar 6).
Tabel 4 Hasil uji fisiologis isolat SAB E-35.
Reaksi Hasil Oksidase + Motilitas + Nitrat + Lisin - Ornitin + H2S - Glukosa + Manitol + Xilosa - ONPG + Indol - Urease + V.P. + Sitrat - TDA + Gelatin + Malonat - Inositol + Sorbitol + Rhamnosa - Sukrosa + Laktosa - Arabinosa + Adonitol - Rafinosa + Salicin + Arginin +
Gambar 5 Hasil uji Gram SAB E-35 dilihat dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10. 10 µm
Gambar 6 Pohon filogenetik menunjukkan kekerabatan isolat SAB E-35 dengan beberapa bakteri laut yang menghasilkan senyawa bioaktif. (Keterangan: Angka 0,1 pada bagian atas pohon menunjukkan skala jarak kekerabatan (distance scale) antar profil isolat bakteri. Angka pada nodus adalah nilai bootstrap dengan 100 ulangan).
PEMBAHASAN
Aktivitas Senyawa Bioaktif pada Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya (Abubakar 2009), dilaporkan bahwa beberapa bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. mempunyai aktivitas antimikrob. Mikrob indikator yang dihambat antara lain S. aureus, E. coli, EPEC, P. aeruginosa, B. subtilis, C. albicans dan C. tropicalis. Dari hasil penapisan tersebut, pada penelitian ini dipilih delapan isolat dengan spektrum penghambatan terluas yaitu SAB 8, SAB 32, SAB 33, SAB 35, SAB 37, SAB E-38, SAB E-40 dan SAB S-43 (Tabel 1). Hasil penapisan awal menunjukkan bahwa SAB E-8, SAB E-32, SAB E-35, SAB E3E-8, dan SAB E-40 mepunyai aktivitas antimikrob terhadap semua mikrob indikator. SAB E-33 hampir menghambat semua mikrob indikator kecuali P. aeruginosa. SAB E-37 tidak dapat meng-hambat C. tropicalis. SAB S-43 mempunyai aktivitas antimikrob terhadap E. coli, EPEC, P. aeruginosa, S. aureus dan B. subtilis.
Penelitian ini melanjutkan hasil penelitian tersebut dengan melakukan penapisan aktivitas antimikrob ekstrak kasar yang dihasilkan dari ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari delapan isolat pilihan tersebut. Ekstrak kasar SAB 8, SAB 32, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-37, SAB E-38, dan SAB S-43 menunjukkan aktifitas antimikrob dengan spektrum penghambatan yang berbeda-beda (Tabel 2). Semua ekstrak kasar
SAB dapat menghambat E. coli, B. subtilis, EPEC, dan P. aeruginosa. S. aureus dapat dihambat oleh ekstrak kasar SAB E-35 dan SAB E-43. C. albicans dihambat oleh ekstrak kasar SAB E-8 dan SAB E-35. C. tropicalis hanya dihambat oleh SAB E-35. Dari hasil tersebut, ekstrak SAB E-35 menunjukkan aktivitas terbaik karena memiliki aktivitas antimikrob terhadap semua mikrob indikator.
Hasil penapisan ekstrak kasar isolat SAB menunjukkan beberapa perbedaan dengan hasil penapisan awal. Beberapa ekstrak kasar isolat SAB tidak menghasilkan aktivitas positif terhadap mikrob indikator yang pada saat penapisan awal dapat dihambat oleh isolat SAB. Dari lima isolat yang dapat menghambat semua mikrob indikator pada penapisan awal, yaitu SAB E-8, SAB E-32, SAB E-35, SAB E-38, dan SAB E-40, hanya terdapat satu ekstrak kasar isolat yaitu SAB E-35 yang dapat menghambat semua mikrob indikator. Ekstrak kasar SAB E-8 tidak dapat menghambat S. aureus dan C. tropicalis. Ekstrak kasar SAB 32, SAB 33, SAB E-37, SAB E-38 dan SAB E-40 tidak dapat menghambat S. aureus, C. albicans dan C. tropicalis. Sedangkan ekstrak kasar SAB S-43 menghasilkan aktivitas yang sama dengan hasil penapisan awal. Selain perbedaan spektrum penghambatan, ukuran zona hambat yang dihasilkan oleh ektrak kasar SAB juga cenderung lebih kecil dibandingkan dengan isolatnya. Umumnya ekstrak kasar SAB hanya menghasilkan ukuran zona hambat dari 0.5-5 mm. Namun beberapa ekstrak kasar SAB bisa
menghasilkan ukuran zona hambat lebih besar yaitu SAB E-35 dan SAB E-43. Ekstrak kasar SAB E-35 menghambat paling kuat terhadap E. coli dan P. aeruginosa dan ekstrak kasar SAB E-43 menghambat paling kuat terhadap P. aeruginosa.
Perbedaan antara hasil penapisan isolat SAB dan ekstrak kasar SAB disebabkan oleh beberapa hal. Pelarut yang digunakan pada saat ekstraksi, yaitu n-butanol, tidak dapat menjerat seluruh senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh isolat SAB sehingga hanya sebagian saja yang terekstraksi. Selain itu, zat-zat pengotor yang terkandung dalam ekstrak dapat menghambat aktivitas dari senyawa antimikrob murni.
Kemampuan berbagai ekstrak kasar isolat SAB dalam menghambat berbagai mikrob indikator disebabkan oleh senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh isolat SAB. Senyawa bioaktif merupakan suatu senyawa metabolit sekunder yang dapat berinteraksi dengan senyawa kimia atau molekul target dari organisme hidup yang lain (Bérdy 2005). Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa bakteri yang berasosiasi dengan spons seperti genus Alteromonas, Pseudomonas, Bacillus dan Flavobacterium memiliki aktifitas antimikrob terhadap E. coli, S. aureus, B. subtilis, Agrobacterium tumefaciens dan Saccharomyces cereviciae (Zheng et al. 2005). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak kasar senyawa antimikrob dari bakteri yang berasosiasi dengan spons memiliki aktivitas terhadap E. coli, EPEC, B. subtilis, P. aeruginosa, S. aureus, C. albicans, dan C. tropicalis.
Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Hasil uji MIC menunjukkan bahwa berbagai isolat SAB memiliki konsentrasi minimum penghambatan yang berbeda-beda (Tabel 3). SAB E-8 menghambat paling kuat terhadap E. coli dan P. aeruginosa, SAB E-32 terhadap E.coli, SAB E-33 terhadap E. coli, P. aeruginosa, dan C. albicans, SAB E-35 terhadap B. subtilis, C. albicans dan C. tropicalis, SAB E-37 terhadap P. aeruginosa, dan SAB E-40 terhadap P. aeruginosa. SAB E-38 meng-hambat paling kuat terhadap B. subtilis dan SAB S-43 terhadap E.coli.
Konsentrasi MIC ini dikonfirmasi kembali dengan melakukan plating untuk mengetahui jenis aktivitas antimikrob. Hasil konfirmasi MIC menunjukkan bahwa semua filtrat isolat SAB memiliki aktivitas menghambat bakteri (bakteriostatik) dan cendawan (fungistatik) karena masih terdapat
mikrob indikator yang tumbuh saat dikonfirmasi. Kemampuan penghambatan suatu antibiotik disebabkan oleh senyawa bioaktif yang dihasilkan memiliki suatu mekanisme tertentu dalam menghambat pertumbuhan mikrob. Contoh mekanisme penghambatan yang dikenal yaitu kelompok
antibiotik β-laktam dan glikopeptida yang menghambat sintesis peptidoglikan pada dinding sel bakteri. Selain itu, terdapat antibiotik yang dapat menghambat sintesis
RNA karena berikatan dengan sub unit β dari
RNA polimerase seperti pada antibiotik rifampisin (Madigan et al. 2006).
Analisis Gen Penyandi PKS dan NRPS. Karakteristik lain bakteri potensial penghasil senyawa bioaktif potensial adalah adanya Poliketida sintase (PKS) dan nonribosomal peptida sintetase (NRPS). PKS dan NRPS merupakan kompleks multienzim dan multidomain yang terlibat dalam biosintesis senyawa poliketida dan nonribosomal peptida (Kealey et al. 1998, Pfeifer & Khosla 2001, Ansari et al. 2004, Tanovic 2008). Senyawa metabolit sekunder tersebut merupakan senyawa yang berperan sebagai prekursor dalam produksi senyawa bioaktif seperti antimikrob, antifungal, antiparasit, antitumor, antikanker, antiinflamasi dan agen imuno-supresan (Pfeifer & Khosla 2001, Ansari et al. 2004). Nonribosomal peptida disintesis oleh kondensasi monomer asam amino. Poliketida dibuat dari penambahan dua unit karbon ketida secara berulang yang berasal dari monomer asil-koenzim A, kemudian setiap unit disusun menjadi polimer linier berupa poliketida (Tanovic et al. 2008).
Hasil deteksi gen PKS menunjukkan bahwa semua isolat SAB positif menyandikan gen domain enzim ketosintase (Gambar 3). Ketosintase merupakan salah satu jenis enzim berperan dalam sintesis poliketida (Schirmer et al. 2005).
Senyawa poliketida dikenal sebagai suatu kelompok produk alam yang banyak dimanfaatkan dalam pengobatan manusia dan hewan (Kealey et al. 1998). Dalam biosintesis poliketida, beberapa enzim dalam cluster PKS yang berperan yaitu ketosintase (KS), acyl carrier protein (ACP), ketoreduktase (KR), dehidratase (DH), dan enoylreduktase (ER) (Pfeifer & Khosla 2001). Beberapa contoh senyawa antibiotilk yang dihasilkan melalui biosintesis poliketida yaitu eritromicin A, avermicin (Marsden et al. 1998), actinor-hodin, doxorubicin, epotilon A, asam 6-metilsalisilat, dan lovastin (Pfeifer & Khosla
2001). Menurut Schirmer et al. (2005), bakteri yang berasosiasi dengan spons diketahui memproduksi banyak senyawa bioaktif termasuk diantaranya adalah poliketida, seperti pada komunitas mikrob yang berasosiasi dengan spons Discodermia dissoluta yang mempunyai keragaman tinggi dan beberapa kelompok dengan domain PKS ketosintase yang spesifik. Fieseler et al. (2007) juga mengemukaan adanya keragaman gen PKS pada berbagai jenis mikrob yang berasosiasi dengan spons dari berbagai jenis spons yang berasal dari beberapa belahan dunia. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa spons Jaspis sp. pun memiliki keragaman bakteri yang memiliki gen PKS. Gen domain ketosintase pada isolat SAB E-35 berhasil diisolasi. Kemudian hasil identifikasi sekuen dengan program Blast-x diketahui bahwa sekuen PKS tersebut termasuk PKS tipe I dengan maksimum identitas sebesar 98%.
Selain itu, deteksi gen NRPS juga menunjukkan hasil positif pada semua isolat SAB yang diuji (Gambar 4). Nonribosomal peptida sintetase merupakan suatu multimodular enzim yang berperan dalam pembentukan peptida yang tidak disintesis di ribosom. Beberapa enzim modular yang bertanggungjawab dalam pembentukn peptida nonribosomal antara lain adenilase (A), peptidyl carrier protein (PCP), dan thioesterase (TE) (Tanovic et al. 2008). Pada beberapa mikrob laut khususnya Cyanobacteria, NRPS meng-hasilkan beberapa senyawa bioaktif antara lain anabaenopeptins, microginins, mikro-sistins, cyanopeptolin, dan aeruginosins (Rounge et al. 2009).
Berdasarkan hasil deteksi gen PKS dan NRPS, semua isolat SAB yang meng-hasilkan senyawa antimikrob mempunyai kedua gen tersebut. Keberadaan kedua gen PKS dan NRPS pada isolat SAB menimbulkan dugaan bahwa kedua gen tersebut membentuk kompleks hibrid seperti yang ditemukan pada beberapa kasus (Maiya et al. 2007, Bergman et al. 2007). PKS dan NRPS disintesis oleh suatu megasintesis polifungsional (200-2000 kDa) dibagi dalam unit-unit fungsional diulang dikenal sebagai modul, yang masing-masing bertanggung jawab untuk tahap diskrit panjang rantai poliketida atau polipeptida. Dalam setiap modul secara independen dilipat domain protein yang bertanggung jawab untuk beberapa kombinasi karakteristik modifikasi gugus fungsional pada setiap siklus panjang rantai biosintesis. Umumnya modul
mega-protein bertanggung jawab terhadap masing-masing jenis biosintesis untuk poliketida dan polipeptida. Namun ditemukan juga sistem hibrid PKS-NRPS, seperti pada sintasis rapamicin (12 PKS modul dan 1 NRPS modul) dan sintesis yersiniabactin (3 NRPS modul dan 1 PKS modul). Keberadaan hibrid PKS-NRPS fungsional menunjukkan bahwa protein NRPS akan berubah menjadi homodimerik juga (Cane & Walsh 1999). Adanya hibrid PKS-NRPS ini sangat menarik karena akan menambah variasi kombinasi modul biosintesis dalam menghasilkan berbagai senyawa bioaktif.
Identifikasi Isolat Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons. Hasil bioassay menunjukkan bahwa aktivitas terbaik adalah isolat SAB E-35. Hasil MIC memper-lihatkan isolat tersebut dapat menghambat tiga mikrob indikator pada konsentrasi yang sangat kecil. SAB E-35 juga terdeteksi memiliki gen PKS dan NRPS. Oleh karena itu, isolat bakteri SAB E-35 didentifikasi lebih lanjut dengan analisis genetik berdasarkan gen 16S rDNA. Hasil Blast-N menunjukkan bahwa isolat SAB E-35 mempunyai homologi terbesar dengan spesies Providencia vermicola strain AR_PSBH1 (identitas maksimum 99%, nilai E 0,0). Providencia vermicola merupakan bakteri mempunyai sel Gram negatif, ukurannya 2.14-5.0 x 0.57-0.71 µ m. Koloni sirkular, diameter 1.8-2.2 mm, bersinar, liat, cembung, buram, dengan kecoklatan di bagian tengah dan tepian bening. Negatif pada reaksi oksidase, positif untuk katalase, urease dan reduksi nitrat dan dapat menfermentasi D-glukosa. Pertumbuhan sampai suhu 41 ºC. Karakteristik biokimia khusus yaitu pada produksi asam dari L-arabinosa, 2-ketoglukonat, serta pemanfaat-an L-eritritol, asam D-glukosamin, dan asam D-glukoronat. (Somvanshi et al. 2006).
Hasil identifikasi fisiologis (Tabel 4) menunjukkan bahwa isolat SAB E-35 merupakan organisme motil yang positif melakukan reaksi oksidase. Reaksi lain yang memperlihatkan hasil yang positif yaitu nitrat, ornitin, glukosa, manitol, ONPG, urease, Voges-Proskauer, TDA, gelatin, inositol, sor-bitol, sukrosa, arabinosa, rafinosa, salicin dan arginin. Sebaliknya reaksi negatif terlihat pada reaksi lisin, H2S, xilosa, indol, sitrat, malonat, ramnosa, laktosa, dan adonitol. Hasil pengamatan uji Gram menunjukkan bahwa SAB E-35 termasuk bakteri Gram negatif berbentuk basil.
Beberapa karakteristik morfologi dan fisiologi pada SAB E-35 sama dengan Providencia vermicola. Keduanya merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basil. Namun terdapat beberapa perbedaan fisiologi yang ditemukan diantara keduanya antara lain pada reaksi oksidase, sitrat, sukrosa, adonitol dan sorbitol dan salicin bila dibandingkan dengan spesies P. vermicola yang didefinisikan Somvanshi et al. (2006). Perbedaan yang lain yaitu P. vermicola diisolasi dari nematode entomopatogen Steinernema thermophilum fase juvenil yang bisa menginfeksi jaringan hidup. Perbedaan tersebut mengindikasi bahwa spesies SAB E-35 kemungkinan adalah spesies yang berbeda dari P. vermicola.
Meskipun hasil uji fisiologis menunjukkan banyak perbedaan dengan P. vermicola, namun hasil identifikasi genetik dengan menggunakan gen 16S rDNA menunjukkan homologi yang besar mencapai 99% dengan beberapa strain dari genus Providencia (Tabel 5). Selain itu penampakan morfologi menunjukkan ciri yang sama dengan genus Providencia yang lain yaitu selnya basil dan Gram negatif (Somvanshi et al. 2006). Providencia merupakan anggota Entero-bacteriaceae yang spesiesnya dikenal sebagai
patogen (O’Hara et al. 2000). Namun, apabila
dilihat dari ciri-ciri fisiologis, SAB E-35 kembali ditemukan beberapa perbedaan dengan genus Providencia secara umum.
Menurut O’Hara et al. (2000), ciri umun
reaksi biokimia pada genus Providencia antara lain positif pada reaksi penggunaan sitrat dan fermentasi manosa, negatif pada reaksi pencairan gelatin (22 ºC), produksi H2S, serta dekarboksilasi lisin dan ornitin. Sedangkan hasil uji fisiologis isolat SAB E-35 menunjukkan reaksi negatif pada reaksi sitrat, positif pada reaksi gelatin dan ornitin. Oleh karena itu, perlu identifikasi lebih lanjut untuk menentukan identitas isolat SAB E-35.
Selain diidentifiksi sekuen gen 16S rDNA dan uji fisiologis, analisis pohon filogenetik juga telah dilakukan. Konstruksi pohon
