• Tidak ada hasil yang ditemukan

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2007 sampai Mei 2008, bertempat di Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi BATAN Jakarta, Kebun Percobaan IPB Pagentongan Sindangbarang Bogor, Laboratorium Anatomi Tumbuhan Departemen Biologi dan Laboratorium BIORIN Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB.

Bahan Tanaman

Bahan tanaman yang digunakan adalah benih kedelai kultivar Slamet dan Lumut.

Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan tahapan seperti pada diagram alir berikut (Gambar 1).

Gambar 1 Diagram alir tahapan penelitian. Radiasi benih kedelai kultivar

Slamet dan Lumut Penanaman I (M-1) untuk

seleksi mutan Penanaman II (M-2) untuk stabilitas mutan

Mutan pendek atau kerdil stabil

Mutan untuk karakter lain

- Pengamatan Stomata - Ekspresi gen Gαdengan

teknik PCR

- Macam-macam mutan - Mutan gen Gα

Radiasi Benih

Benih kedelai kultivar Slamet dan Lumut diradiasi dengan sinar gamma (60Co) dengan 6 taraf dosis yaitu : 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4 dan 0.5 kGy. Pada setiap perlakuan diradiasi 200 biji kedelai. Kombinasi dari dosis irradiasi dengan kultivar membentuk 12 populasi yaitu populasi 1 (Lumut kontrol), populasi 2 (Lumut dosis irradiasi 0.1 kGy), populasi 3 (Lumut 0.2 kGy), populasi 4 (Lumut 0.3 kGy), populasi 5 (Lumut 0.4 kGy), populasi 6 (Lumut 0.5 kGy), populasi 7 (Slamet kontrol), populasi 8 (Slamet 0.1 kGy), populasi 9 (Slamet 0.2 kGy), populasi 10 (Slamet 0.3 kGy), populasi 11 (Slamet 0.4 kGy), dan populasi 12 (Slamet 0.5 kGy).

Penanaman di Lapang

Benih kedelai yang sudah diradiasi langsung ditanam di lapang selama 2 periode tanam. Pada musim tanam pertama (M-1), penanaman dilakukan mengikuti pola Rancangan Acak Kelompok dengan 2 faktor (kultivar dan dosis irradiasi) yang diulang pada 3 kelompok. Tiap petak terdapat 100 lubang, masing-masing lubang berisi 2 biji kedelai. Jarak antar lubang tanam adalah 40 cm x 20 cm. Pemupukan dilakukan pada saat tanam dengan pupuk Urea dosis 50 kg/Ha, TSP 100 kg/Ha dan KCl 50/Ha. Hama diatasi dengan memakai Acodan. Penyiangan dilakukan tiap dua minggu sekali. Panen dilakukan per tanaman, masing-masing tanaman dimasukkan dalam kantong. Selanjutnya dilakukan seleksi terhadap tanaman yang menunjukkan indikasi mutan yaitu memiliki ukuran batang pendek atau kerdil serta tipe mutasi untuk karakter lain seperti warna biji, jumlah anak daun, bentuk daun, motif daun, dan warna bunga. Benih kedelai yang berindikasi mutan ditanam kembali sebagai tanaman M-2. Penanaman kedua dilakukan mengikuti pola Rancangan Acak Lengkap. Benih ditanam dengan membentuk barisan yang bersambungan antara satu induk dengan induk yang lain. Tiap induk diambil 30 biji, namun untuk induk yang memiliki jumlah biji kurang dari 30, biji ditanam semua. Hasil seleksi periode tanam 1, dari 657 induk ditanam sebanyak 10 216 tanaman.

Observasi Lapang dan Deteksi Mutasi

Karakter yang diamati pada tanaman M-1 meliputi tinggi tanaman, jumlah cabang, jumlah buku subur, jumlah buku total, jumlah polong isi, jumlah polong total, umur mulai berbunga, umur polong masak, warna polong, jumlah biji, berat total biji, berat 100 biji, warna biji, jumlah anak daun, motif daun, bentuk daun dan warna bunga. Mutasi dideteksi dari adanya perubahan pada karakter yang diamati. Mutasi pada gen Gα ditunjukkan oleh adanya batang yang pendek. Observasi pada tanaman M-2 diarahkan untuk melihat kestabilan karakter yang dianggap bermutasi yaitu melalui ada tidaknya segregasi pada karakter tersebut. Tanaman yang diduga mutan yang sudah stabil (kerdil) selanjutnya diperiksa struktur stomata dan ekspresi gen Gα nya.

Preparasi Struktur Anatomi Stomata

Pengamatan struktur anatomi stomata dengan menggunakan sediaan paradermal. Sediaan paradermal dibuat dalam bentuk sediaan semipermanen dengan metode Wholemount (Johansenn 1940). Pengamatan struktur anatomi stomata dilakukan terhadap tigapuluh sampel tanaman pendek atau kerdil dan wild type (kontrol). Pengambilan sampel dilakukan pada waktu dan kondisi yang sama (pukul 12.00 WIB). Bahan untuk pembuatan sediaan paradermal stomata adalah alkohol 70% (v/v), safranin 1% (b/v), pemutih (bayclin 5.25%) (v/v), gliserin 30% (v/v), cat kuku. Langkah-langkahnya; daun difiksasi dengan alkohol 70% (v/v), dicuci, kemudian disayat dengan silet. Hasil sayatan direndam dalam larutan pemutih (bayclin 5.25%) (v/v) selama sepuluh menit, sayatan dicuci kembali kemudian dilakukan pewarnaan menggunakan safranin 1% (b/v) selama sepuluh menit, sediaan diletakkan dalam gelas obyek, diberi media gliserin 30% (v/v) lalu ditutup dengan gelas penutup.

Ekspresi Gen Gα dengan Teknik PCR

Isolasi RNA Total. Isolasi RNA total dilakukan pada tanaman M-2 yang telah diseleksi. RNA diambil dari tanaman mutan dan wild type yang tidak diradiasi sebagai kontrol. Isolasi RNA total dengan menggunakan Kit Trizol (Invitrogen). Langkah isolasi RNA sebagai berikut : Daun sebanyak 500 – 1000 mg dari masing-masing perlakuan secara terpisah digerus di mortar dengan bantuan N2

cair sampai berbentuk tepung halus. Kemudian dicampur dengan 800 µl kit trizol. Campuran selanjutnya diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang kemudian ditambah dengan 200 µl chloroform dan dikocok selama 30 detik dan diinkubasi selama 3 menit dalam suhu ruang. Campuran disentrifugasi pada 9000 rpm (Jouan BR4i) selama 15 menit pada suhu 6 ºC. Cairan bagian atas diambil dan dipindahkan ke tabung baru. Selanjutnya ditambah dengan 500 µl isopropil alkohol dan diinkubasi 10 menit pada suhu ruang. Kemudian disentrifugasi pada 9000 rpm selama 10 menit pada 6 ºC. Endapan yang dihasilkan dicuci dengan penambahan 500 µl ethanol-DEPC 75% dan diikuti dengan sentrifugasi pada 5700 rpm selama 5 menit pada suhu 6 ºC. Endapan dikeringkan dengan vakum dryer selama 6 menit dan dilarutkan dalam 30 µl ddH2O-DEPC 0.1%. Kuantifikasi dilakukan dengan melarutkan 1 µl larutan RNA total dalam 700 µl ddH2O-DEPC 0.1%, selanjutnya dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Untuk mengetahui kemurnian RNA dari kontaminasi protein dilakukan dengan perhitungan nilai rasio OD260/280 (Sambrook et al. 1989). Keutuhan RNA dianalisis dengan memigrasikan RNA pada gel agarosa 1% dengan menggunakan buffer MOPS 1 X (4.2 g/l 3-Morpholinopropanesulfonic acid (C7H15NO4), 0.41 g/l Na-asetat, 0.37 g/l Na2EDTA.H2O). 10 µg RNA total ditambah dengan 12 µl premix (20 X MOPS, 6 µl formamide, 2.1 µl formaldehide, 3.3 µl ddH2O-DEPC 0.1%) dipanaskan pada suhu 65 ºC selama 10 menit. Selanjutnya diinkubasi dalam es selama 5 menit, kemudian ditambahkan 2 µl loading dye dengan komposisi bromofenol biru 0.25% (b/v), xylene cyanol 0.25% (b/v) dan sukrosa 15% (b/v). Campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel dan dimigrasikan selama 30 menit pada bak elektroforesis dengan tegangan 100 volt. Selanjutnya gel direndam di dalam larutan ethidium bromida 0.5 µg/ml selama 10 menit, dibilas dengan akuades, kemudian pita RNA dilihat melalui UV transiluminator.

Sintesis cDNA. Sintesis cDNA dilakukan dengan mengikuti metode Suharsono et al. (2002). Lima mikrogram RNA total dicampur dengan 4 µl 5 X buffer reaksi, 2 µl primer oligo dT, 1 unit enzim Reverse Transcriptase III (Invitrogen), 1 µl dTT (0.1 M), 0.16 µl dNTP mix 25 mM dan ddH2O-DEPC 0.1% steril sampai

volume akhir 20 µl. Reaksi transkripsi balik (RT) dilakukan pada suhu 30 ºC 10 menit, 42 ºC 50 menit, 95 ºC 5 menit sebanyak satu siklus. Untuk mengetahui keberhasilan sintesis cDNA dilakukan amplifikasi cDNA melalui PCR dengan menggunakan primer aktin yang didesain dari kedelai (Accession V00450) dengan primer forward tepat pada kodon awal (5’ATGGCAGATGCCGAGG

ATAT 3’) dari ekson 1 dan primer reverse tepat pada daerah ekson 2 (5’ CAGTTGTGCGACCACTTGCA 3’) dan menggunakan cDNA sebagai

cetakan. PCR dilakukan dengan mencampur 1 µl hasil RT dengan 1 µl buffer Taq 10 X, 0.08 dNTPmix 25 mM, 0.4 µl DMSO, 1 unit enzim Taq polymerase, 10 pmol primer forward, 10 pmol primer reverse dan ddH2O sampai volume akhir 10 µl. Kondisi PCR untuk aktin adalah: denaturasi pra-PCR 95 ºC 5 menit, denaturasi pada 94 ºC 30 detik, penempelan primer pada 55 ºC 1 menit, pemanjangan DNA pada 72 ºC 1 menit 30 detik, siklus diulang sebanyak 35 kali, pemanjangan pasca PCR pada 72 ºC 5 menit dan proses pendinginan dilakukan pada 15 ºC 5 menit.

Analisis Ekspresi Gen Gαααα. Analisis ekspresi gen Gα dilakukan dengan RT-PCR menggunakan primer spesifik Gα. Primer didesain dari Soybean G protein α subunit, SGA1 (Accession: L27418) dengan primer terletak pada 111 nukleotida sebelum kodon awal (5’ GCTTCACACTTCACACTTAACACT 3’) dan 114 sesudah stop kodon (5’ ATATTGTTGTATACCTGACCTC 3’) digunakan untuk mengamplifikasi cDNA dari gen Gα. PCR dilakukan dengan mencampur 1 µl hasil RT dengan 1 µl buffer Taq 10 X, 0.08 dNTPmix 25 mM, 0.4 µl DMSO, 1 unit enzim Taq polymerase, 10 pmol primer forward, 10 pmol primer reverse dan ddH2O sampai volume akhir 10 µl. Kondisi PCR untuk gen Gα adalah denaturasi pra-PCR 95 ºC 5 menit, denaturasi pada 94 ºC 30 detik, penempelan primer pada 58 ºC 1 menit, pemanjangan DNA pada 72 ºC 2 menit, siklus diulang sebanyak 37 kali, pemanjangan pasca PCR pada 72 ºC 5 menit dan proses pendinginan dilakukan pada 15 ºC 5 menit. Kehilangan gen Gα dilihat dengan membandingkan ekspresi antara mutan, tanaman wild type dan kontrol positif (Plasmid membawa gen Gα), yang ditandai dari ada tidaknya pita atau jumlahnya berubah menjadi lebih dari satu pita.

Analisis Data

Data morfologi dianalisis dengan Analisis Diskriminan untuk melihat kelompok mutan yang terbentuk. Kelompok yang dianggap mutan ialah yang memperlihatkan perbedaan dari wild type. Untuk melihat kestabilan mutan, populasi masing-masing mutan dibandingkan dengan populasi wild type dan induk, selanjutnya dilakukan uji beda nyata dengan uji T pada taraf nyata 5%.

Data molekuler berupa pita dianalisis dengan ada tidaknya pita pada mutan atau perubahan jumlah pita dibandingkan dengan wild type (kontrol). Tanaman yang tidak memiliki pita atau penurunan intensitas perpendaran atau perubahan jumlah pita dikategorikan mutan.

HASIL

Analisis Diskriminan terhadap Tanaman M-1

Uji keragaman pada dua belas populasi yang diteliti menunjukkan adanya perbedaan yang nyata antar populasi (Lampiran 1). Keragaman tersebut terlihat pada semua karakter yang diamati, selain karakter warna polong.

Hasil analisis diskriminan menunjukkan adanya keragaman individu intra populasi yang cukup besar pada keduabelas populasi awal, sehingga terjadi tumpang tindih antar populasi. Masing-masing populasi menyebar ke kelompok populasi lain yang memiliki persamaan karakter (Tabel 1). Angka 1 sampai 12 pada tabel 1 merupakan kelompok hasil analisis diskriminan dengan jumlah anggota masing-masing. Populasi 1 (Lumut wild type) memiliki 464 anggota kelompok yang mirip Lumut dan 66 mirip populasi 2 (Lumut 0.1 kGy). Jika dilihat sebaran dari populasi 1, tampak bahwa populasi 1 terbagi menjadi dua kelompok. Populasi Lumut yang dikategorikan mutan adalah yang berada pada kelompok 3 sampai 12. Populasi 2 sampai 6 yang tergabung dalam kelompok 1 dan 2 tidak dikategorikan mutan karena masih mirip dengan populasi 1.

Tabel 1 Hasil pengelompokan dua belas populasi dari analisis diskriminan Prediksi jumlah anggota kelompok hasil analisis diskriminan Populasi Awal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Lumut kontrol (1) 464 66 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Lumut 0,1 kGy (2) 48 267 179 0 0 0 1 3 0 3 7 0 Lumut 0,2 kGy (3) 22 102 278 0 0 1 0 2 1 0 2 0 Lumut 0,3 kGy (4) 1 12 4 112 44 1 0 0 0 0 1 0 Lumut 0,4 kGy (5) 0 5 5 41 44 0 0 0 0 0 3 0 Lumut 0,5 kGy (6) 0 0 1 1 7 1 0 0 0 0 0 0 Slamet kontrol (7) 1 0 0 0 0 0 512 11 2 0 0 0 Slamet 0,1 kGy (8) 0 10 2 0 0 3 68 193 160 21 0 8 Slamet 0,2 kGy (9) 0 2 0 0 0 1 55 144 254 18 4 8 Slamet 0,3 kGy (10) 0 3 1 10 2 2 1 23 49 88 42 54 Slamet 0,4 kGy (11) 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 9 1 Slamet 0,5 kGy (12) 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1

Populasi 7 (Slamet wild type) tampak lebih seragam, hampir semua anggotanya mengelompok dalam kelompok 7 (97.3%). Populasi Slamet yang berada di luar kelompok 7 dikategorikan mutan. Populasi 8 sampai 12 yang masuk ke dalam kelompok 7 tidak dikategorikan mutan karena masih mirip dengan populasi 7.

Berdasarkan hasil analisis diskriminan terhadap dua belas populasi awal diperoleh enam kelompok baru, yaitu kelompok A, B, C, D, E dan F (Tabel 2). Masing-masing kelompok memiliki karakter yang berbeda-beda. Kelompok A dan kelompok D merupakan kelompok tanaman yang mempunyai sifat mirip dengan tanaman wild type Lumut dan Slamet dan sebagian besar berisi tanaman dari kedua kultivar tersebut. Kelompok B, C, E dan F merupakan kelompok yang menunjukkan perubahan karakter dari kelompok wild type, A dan D.

Hasil pengklasifikasian diperoleh individu-individu yang memiliki karakter berbeda dengan wild type, yang selanjutnya disebut tipe mutan. Tipe mutan disajikan dalam kelompok terpisah sesuai tipe mutannya.

Tabel 2 Asal populasi dan karakter enam kelompok baru hasil analisis diskriminan

Kelompok Asal populasi Karakter

A (kontrol), 2 (62%), Populasi 1

dan 3 (30.4%)

Rata-rata: tinggi 67 cm, jumlah cabang 4, buku subur 13, buku total 14, polong isi 66, polong total 67, umur polong masak 94 hari, umur mulai bunga 42 hari, jumlah biji 134, berat total 9.9 g, berat 100 biji 7.8 g, warna biji hijau kekuningan, jumlah anak daun 3 (trifoliate), motif daun polos, bentuk daun bulat telur, warna bunga ungu.

B Populasi 2 (32.5%), populasi 3 (68.1%) dan sebagian kecil populasi lainnya

Tanaman lebih pendek (rata-rata 58.9 cm).Terjadi penurunan pada jumlah cabang, buku subur, buku total, polong isi, polong total, jumlah biji serta berat total. Umur mulai bunga dan umur polong masak lebih lama, dan terjadi perubahan pada karakter jumlah anak daun. Ukuran biji relatif lebih besar (9.1 g/100 biji).

C (89.7%), 5 (86.7%) Populasi 4

dan 6 (90%)

Tanaman pendek (rata-rata 42.5 cm). Terjadi penurunan pada jumlah cabang, buku subur dan buku total, polong isi dan polong total, jumlah biji serta berat total,umur mulai bunga dan umur polong masak menjadi lebih lama, dan terjadi perubahan karakter warna biji, jumlah anak daun, dan bentuk daun. Rata-rata ukuran biji lebih besar ( 8.8 g/100 biji). Namun pada kelompok ini prosentase kematian sangat tinggi, terutama pada populasi 5 dan 6. D Populasi 7 (kontrol), 8 (14.6%) dan populasi 9 (11.3%).

Rata-rata: tinggi 60.5 cm, jumlah cabang 4, buku subur 12, buku total 14, polong isi 55, polong total 56, umur polong masak 88 hari, umur mulai bunga 37 hari, jumlah biji 115, berat total 10.5 g, berat 100 biji 9.2 g, warna biji kuning, jumlah anak daun 3 (trifoliate), motif daun polos, bentuk daun bulat telur, warna bunga ungu.

E Populasi 8 (80.4%), 9 (85.6%), 10 (58.2%), dan populasi 12 (66.7%) serta sebagian kecil populasi 11

Tanaman lebih pendek (rata-rata 52.7 cm), Terjadi penurunan pada jumlah cabang, buku subur dan buku total, polong isi dan polong total, jumlah biji serta berat total. Rata-rata ukuran biji lebih besar (11.1 g/100 biji). Umur mulai bunga dan umur polong masak menjadi lebih lama, dan terjadi perubahan karakter warna biji, jumlah anak daun dan warna bunga.

F Populasi 11 (83.3%), 10 (34.9%), 12 (33.3%), serta sebagian kecil populasi 8 dan 9.

Tanaman pendek (rata-rata 39.3 cm), terjadi penurunan pada jumlah cabang, buku subur dan buku total, polong isi dan polong total, jumlah biji serta berat total. Rata-rata ukuran biji lebih besar (9.9 g/100 biji). Umur mulai bunga dan umur polong masak menjadi lebih lama, terjadi perubahan pada warna biji, jumlah anak daun, motif daun, dan warna bunga.

Tipe-Tipe Mutan pada Tanaman M-1

Mutan Warna Biji

Kulit biji kedelai umumnya berwarna coklat, kuning, atau hitam atau kombinasi dari warna tersebut. Kedelai kultivar Lumut memiliki warna biji hijau kekuningan, sedangkan Slamet memiliki warna biji kuning. Irradiasi gamma menyebabkan perubahan warna biji kedua kultivar ini. Pada kultivar Lumut warna biji menjadi adalah kuning, kuning kecoklatan dan hijau kehitaman, sedangkan kultivar Slamet meliputi coklat, krem dan kuning kehijauan (Gambar 2). Mutasi warna biji pada kultivar lumut hanya dihasilkan pada dosis 0.1 kGy, sedangkan Slamet pada dosis 0.1 sampai 0.4 kGy dengan frekuensi yang berbeda-beda (Tabel 3).

Lumut Slamet

Gambar 2 Variasi warna biji kedelai kultivar Lumut dan Slamet. (1) Kuning kehijauan, (2) Kuning, (3) Kuning kecoklatan, (4) Hijau kehitaman, (5) Kuning, (6) Coklat, (7) Krem, (8) Kuning kehijauan.

Tabel 3 Jumlah tanaman M-1, jumlah mutan dan frekuensi mutan warna biji per seribu tanaman M-1 pada lima dosis irradiasi kultivar Lumut dan Slamet

Kultivar Dosis irradiasi (kGy) Jumlah tanaman M-1 Jumlah mutan Frekuensi mutan Lumut 0.1 510 3 0.006 Lumut 0.2 409 - - Lumut 0.3 175 - - Lumut 0.4 100 - - Lumut 0.5 10 - - Slamet 0.1 465 4 0.009 Slamet 0.2 486 1 0.002 Slamet 0.3 275 3 0.011 Slamet 0.4 12 1 0.083 Slamet 0.5 3 - - 1 2 4 3 5 6 8 7 Kontrol Kontrol

Mutan Warna Bunga

Kedelai umumnya memiliki warna bunga ungu atau putih. Kedelai kultivar Lumut dan Slamet memiliki warna bunga ungu. Irradiasi sinar gamma menyebabkan perubahan warna bunga kedelai pada kedua kultivar tersebut. Perubahan warna yang dihasilkan adalah ungu muda dan putih (Gambar 3). Kultivar Slamet memiliki frekuensi mutasi warna bunga lebih tinggi dibandingkan Lumut (Tabel 4). Mutan warna bunga hanya dihasilkan pada Lumut dosis 0.1, 0.2 dan 0.4 kGy, sedangkan Slamet dihasilkan pada dosis 0.1 sampai 0.4 kGy.

1 2 3

Gambar 3 Variasi warna bunga kedelai kultivar Lumut dan Slamet. (1) Warna bunga tipe liar Lumut dan Slamet, (2) Bunga ungu muda pada kultivar Lumut dan Slamet, (3) Bunga putih pada kultivar Lumut. Tabel 4 Jumlah tanaman M-1, jumlah mutan dan frekuensi mutan warna bunga

per seribu tanaman M-1 pada lima dosis irradiasi kultivar Lumut dan Slamet

Kultivar Dosis irradiasi (kGy) Jumlah tanaman M-1 Jumlah mutan Frekuensi mutan Lumut 0.1 510 1 0.002 Lumut 0.2 409 1 0.002 Lumut 0.3 175 - - Lumut 0.4 100 1 0.010 Lumut 0.5 10 - - Slamet 0.1 465 1 0.002 Slamet 0.2 486 1 0.002 Slamet 0.3 275 1 0.004 Slamet 0.4 12 1 0.083 Slamet 0.5 3 - - 20

Mutan Jumlah Anak Daun

Kedelai umumnya memiliki jumlah anak daun 3 (trifoliate). Kedelai kultivar Lumut dan Slamet yang diradiasi gamma memiliki jumlah anak daun bervariasi. Variasi jumlah anak daun antara lain: kombinasi antara jumlah anak daun 2 dan 3, kombinasi 3 dan 4, kombinasi 3 dan 5, kombinasi 1, 2 dan 3, kombinasi 2, 3 dan 4, kombinasi 2, 3 dan 5, kombinasi 3, 4 dan 5 serta kombinasi 2, 3, 4 dan 5 (Gambar 4).

Gambar 4 Variasi jumlah anak daun kedelai kultivar Lumut dan Slamet. (1) Jumlah anak daun satu, (2) Jumlah anak daun dua, (3) Jumlah anak daun tiga (wild type), (4) Jumlah anak daun empat, (5) Jumlah anak daun lima.

Tabel 5 Jumlah tanaman M-1, jumlah mutan dan frekuensi mutan jumlah anak daun per seribu tanaman M-1 pada lima dosis irradiasi kultivar Lumut dan Slamet

Kultivar Dosis irradiasi (kGy) Jumlah tanaman M-1 Jumlah mutan Frekuensi mutan Lumut 0.1 510 10 0.020 Lumut 0.2 409 12 0.029 Lumut 0.3 175 13 0.074 Lumut 0.4 100 4 0.040 Lumut 0.5 10 - - Slamet 0.1 465 7 0.015 Slamet 0.2 486 5 0.010 Slamet 0.3 275 14 0.051 Slamet 0.4 12 - - Slamet 0.5 3 - - 1 2 3 4 5

Frekuensi mutan jumlah anak daun tertinggi terjadi pada kedua kultivar untuk dosis 0.3 kGy. Kultivar Lumut dosis 0.5 kGy tidak menghasilkan mutan jumlah anak daun, demikian pula pada Slamet dosis 0.4 dan 0.5 kGy (Tabel 5).

Mutan Bentuk Daun

Kedelai secara umum memiliki bentuk daun bulat telur sampai lancip. Irradiasi gamma menyebabkan variasi bentuk daun bulat dan memanjang (Gambar 5). Frekuensi mutan bentuk daun tertinggi terdapat pada kedelai kultivar Lumut dosis irradiasi 0.5 kGy. Pada kultivar ini, mutasi bentuk daun hanya terjadi pada dosis 0.3 dan 0.5 kGy. Mutasi bentuk daun pada kultivar Slamet dihasilkan oleh dosis 0.1 sampai 0.3 kGy, sedangkan pada dosis 0.4 dan 0.5 kGy tidak menghasilkan mutan bentuk daun (Tabel 6).

Gambar 5 Variasi bentuk daun kedelai kultivar Lumut dan Slamet. (1) Bentuk daun bulat telur (wild type), (2) Daun memanjang, (3) Daun bulat. Tabel 6 Jumlah tanaman M-1, jumlah mutan dan frekuensi mutan bentuk daun

per seribu tanaman M-1 pada lima dosis irradiasi kultivar Lumut dan Slamet

Kultivar Dosis irradiasi (kGy)

Jumlah

tanaman M-1 Jumlah mutan

Frekuensi mutan Lumut 0.1 510 - - Lumut 0.2 409 - - Lumut 0.3 175 1 0.006 Lumut 0.4 100 - - Lumut 0.5 10 1 0.100 Slamet 0.1 465 2 0.004 Slamet 0.2 486 1 0.002 Slamet 0.3 275 2 0.007 Slamet 0.4 12 - - Slamet 0.5 3 - - 1 2 3 5 cm 22

Mutan Motif Daun

Daun kedelai memiliki motif atau tekstur polos. Induksi dengan irradiasi sinar gamma menyebabkan daun kedelai menjadi bervariasi motifnya. Variasi motif daun tersebut antara lain : pinggiran putih, totol-totol tua muda, keriput, dan tebal gelap (Gambar 6).

Gambar 6 Variasi motif daun kedelai kultivar Lumut dan Slamet. (1) Polos (wild type), (2) Daun keriput, (3) Daun totol tua muda, (4) Daun pinggiran putih, dan (5) Daun tebal gelap.

Tabel 7 Jumlah tanaman M-1, jumlah mutan dan frekuensi mutan motif daun per seribu tanaman M-1 pada lima dosis irradiasi kultivar Lumut dan Slamet

Kultivar Dosis irradiasi (kGy) Jumlah tanaman M-1 Jumlah mutan Frekuensi mutan Lumut 0.1 510 6 0.012 Lumut 0.2 409 1 0.002 Lumut 0.3 175 1 0.006 Lumut 0.4 100 1 0.010 Lumut 0.5 10 1 0.100 Slamet 0.1 465 - - Slamet 0.2 486 - - Slamet 0.3 275 2 0.007 Slamet 0.4 12 - - Slamet 0.5 3 - - 1 3 4 5 2

Frekuensi mutan motif daun bervariasi pada berbagai dosis irradiasi yang diberikan. Mutasi tipe ini lebih banyak terjadi pada kultivar Lumut dibandingkan Slamet. Pada kultivar Lumut dihasilkan mutan motif daun pada kelima dosis irradiasi, namun kultivar Slamet hanya dihasilkan pada dosis 0.3 kGy. Frekuensi mutan tertinggi terjadi pada kedelai kultivar Lumut dosis 0.5 kGy (Tabel 7).

Mutan Biji Besar

Ukuran kedelai kultivar Lumut tergolong kecil bobot 100 biji kurang dari 10 gram, kultivar Slamet memiliki ukuran biji sedang (12.5 g/100 biji). Pada tanaman M-1 dari kedua kultivar diperoleh sebelas mutan biji besar dengan bobot 100 biji antara 16 gram sampai 19 gram. Pada kultivar Lumut terdapat mutan yang menghasilkan ukuran biji yang besar (Gambar 7).

Gambar 7 Perbandingan ukuran biji pada kultivar Lumut wild type dengan mutan.

Mutan Pendek

Kultivar Lumut memiliki rata-rata tinggi 75 cm, sedangkan Slamet rata-rata 60 cm. Akibat irradiasi gamma terjadi perubahan karakter pada tinggi tanaman dimana tanaman menjadi lebih pendek (Gambar 8). Jumlah dan frekuensi mutan pada masing-masing kultivar tidak sama (Tabel 8). Mutan pendek lebih banyak dihasilkan pada dosis irradiasi 0.3 sampai 0.5 kGy pada kedua kultivar, namun frekuensi tertinggi dihasilkan pada dosis 0.4 kGy untuk kultivar Lumut dan 0.3 kGy untuk kultivar Slamet.

Lumut biji besar Lumut wild type

Lumut Slamet

Gambar 8 Mutan pendek pada kedelai kultivar Lumut dan Slamet. (1) Lumut wild type, (2) Lumut pendek, (3) Slamet wild type, (4) Slamet pendek. Tabel 8 Jumlah tanaman M-1, jumlah mutan dan frekuensi mutan pendek per

seribu tanaman M-1 pada lima dosis irradiasi kultivar Lumut dan Slamet

Kultivar Dosis irradiasi (kGy) Jumlah tanaman M-1 Jumlah mutan Frekuensi mutan Lumut 0.1 510 79 0.155 Lumut 0.2 409 103 0.252 Lumut 0.3 175 91 0.520 Lumut 0.4 100 60 0.600 Lumut 0.5 10 5 0.500 Slamet 0.1 465 90 0.194 Slamet 0.2 486 78 0.160 Slamet 0.3 275 120 0.436 Slamet 0.4 12 5 0.417 Slamet 0.5 3 1 0.333 Uji Stabilitas M-2

Untuk uji stabilitas mutan dilakukan penanaman kembali tanaman mutan sebagai generasi M-2. Selanjutnya diperiksa apakah terjadi segregasi atau tidak. Mutan yang stabil diindikasikan oleh tidak adanya segregasi pada sifat yang

1 2 3 4

5 cm

termutasi. Pada tipe mutan M-1, karakter yang mengalami segregasi pada semua generasi M-2 adalah tipe mutan warna biji dan motif daun. Pada tipe mutan lainnya yaitu mutan warna bunga, mutan jumlah anak daun, mutan bentuk daun, mutan biji besar dan mutan pendek ada yang mengalami segregasi ada yang tidak.

Perubahan Warna Bunga

Hasil pengamatan segregasi terhadap mutan warna bunga menunjukkan bahwa sifat bunga ungu muda mengalami segregasi sedangkan bunga putih tidak (Tabel 9). Adanya segregasi menunjukkan bahwa tidak terjadi mutasi. Pada kedelai yang memiliki warna bunga putih menunjukkan bahwa telah terjadi mutasi pada tanaman tersebut dan mutasinya stabil sehingga generasi berikutnya akan memiliki karakter yang tetap.

Tabel 9 Warna bunga M-1, jumlah keturunan dan segregasi warna bunga M-2 dari tujuh induk mutan kultivar Lumut dan Slamet

Segregasi warna bunga M-2 Induk Asal induk Warna bunga

M-1

Jumlah

keturunan Ungu Ungu muda Putih

1 Lumut 0.1 kGy Putih 3 - - 3

2 Lumut 0.2 kGy Ungu muda 6 5 1 -

3 Lumut 0.4 kGy Putih 16 - - 16

4 Slamet 0.1 kGy Ungu muda 25 6 19 -

5 Slamet 0.2 kGy Ungu muda 2 1 1 -

6 Slamet 0.3 kGy Ungu muda 29 11 18 -

7 Slamet 0.4 kGy Ungu muda 9 8 1 -

Perubahan Jumlah Anak Daun

Setelah dilakukan pengamatan segregasi terhadap enam puluh mutan jumlah anak daun (Lampiran 2) diperoleh hasil bahwa terdapat sembilan tanaman yang stabil mengalami perubahan karakter jumlah anak daun (Tabel 10). Hal ini ditunjukkan oleh tidak adanya segregasi pada karakter tersebut. Tanaman wild type (kontrol) memiliki jumlah anak daun tiga (trifoliate), sedangkan pada tanaman mutan ditemukan adanya variasi jumlah anak daun 1, 2, 3, 4, dan 5.

Tabel 10 Jumlah anak daun M-1, jumlah keturunan dan segregasi jumlah anak daun M-2 dari sembilan induk mutan kultivar Lumut dan Slamet

Segregasi jumlah anak daun M-2 Induk Asal induk Jumlah anak daun

M-1

Jumlah keturunan

(M-2) Trifoliat

(3) Variasi

1 Lumut 0.1 kGy Variasi 2 dan 3 1 - 1

2 Lumut 0.1 kGy Variasi 3 dan 4 2 - 2

3 Lumut 0.2 kGy Variasi 3 dan 4 1 - 1

4 Lumut 0.2 kGy Variasi 2 dan 3 1 - 1

5 Lumut 0.2 kGy Variasi 4 dan 5 1 - 1

6 Lumut 0.3 kGy Variasi 3 dan 4 1 - 1

7 Lumut 0.3 kGy Variasi 3 dan 4 1 - 1

8 Lumut 0.3 kGy Variasi 3, 4 dan 5 1 - 1

9 Slamet 0.2 kGy Variasi 3 dan 5 12 - 12

Dokumen terkait