Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei sampai November 2012 Pengambilan sampel tanah dilakukan dilahan bekas kebakaran hutan Desa Tongging Kabupaten Karo. Analisis tanah dilaksanakan di Laboratorium Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Sumatera Utara. Isolasi jamur dan uji potensi jamur pelarut fosfat dilaksanakan di Laboratorium Biologi Tanah Program Studi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah contoh tanah disekitar rhizosfer vegetasi alang-alang pada lahan bekas kebakaran hutan yang terjadi sekitar 2 tahun yang lalu, kapas, akuades, kantung plastik, label, alkohol 96%, plastik kraf, aluminium foil, kaca preparat, kaca objek dan kertas saring (whatman No 42). Media padat Pikovskaya untuk komposisi per liter akuades: (glukosa 10 g; Ca3(PO4)2 5 g; (NH4)2SO4 0,5 g; KCl 0,2 g; MgSO4.7H2O 0,1 g; MnSO4 0,002 g; FeSO4 0,002 g; ekstrak khamir 0,5 g; agar 20 g; akuades), larutan fisiologis (8,5 g NaCl per liter akuades), AlPO4 5 gr, FePO4 5 gr dan batuan fosfat 5 gr.
Alat yang digunakan adalah cangkul, Erlenmeyer 250 ml, pipet tetes, cawan petri, tabung reaksi, timbangan, inkubator, laminar air flow, gelas ukur volume 100 ml, autoklaf, rotarimixer, sentrifuse 6000 rpm, shaker, jarum ose, sprayer, kamera digital, masker, sarung tangan, bunsen, kotak es (cool box) dan mikroskop.
Prosedur Penelitian
1. Pengambilan contoh tanah
Pengambilan sampel diambil secara zig-zag dari 50 titik pada kedalaman 0-20 cm di sekitar rhizosfer tanaman menggunakan cangkul. Berat tanah yang diambil pada tiap titik adalah 250 g sehingga total berat sampel tanah adalah 12500 g. Sampel tanah dari tiap titik dimasukkan dalam kantung plastik yang terpisah. Sampel tanah selanjutnya dibawa ke laboratorium biologi tanah untuk kegiatan penelitian selanjutnya. Sampel tanah dianalisis pH, C-organik, N-total, P-tersedia, P-total dan Al-dd di Laboratorium Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Sumatera Utara.
2. Isolasi jamur pelarut fosfat
Sepuluh (10) g tanah dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 250 ml yang berisi 90 ml larutan fisiologis steril (pengenceran 10-1), kemudian dikocok selama 30 menit pada shaker. Dibuat pengenceran secara serial, dari pengenceran 10-1 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml larutan fisiologis steril (pengenceran 10-2) selanjutnya dikocok di atas rotarimixer sampai homogen. Dari pengenceran 10-2 dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan fisiologis (disebut pengenceran 10-3) dilakukan hal serupa berturut-turut sampai pengenceran 10-5. Dari pengenceran 10-3 dipipet sebanyak 1 ml, masukkan ke dalam cawan petri yang telah steril dan dilakukan hal yang sama pada pengenceran 10-4 dan 10-5. Dipakai suspensi tanah dari 3 pengenceran sebagai antisipasi bila pada pengenceran tersebut tidak diperoleh jamur pelarut fosfat. Selanjutnya tuangkan 12 ml media
Pikovskaya (suhu sekitar 45-50ºC) ke dalam cawan petri yang telah berisi 1 ml suspensi tanah, lalu putar cawan petri kearah kanan 3 kali dan ke arah kiri 3 kali agar media bercampur secara merata, biarkan sampai media mengeras (padat). Setelah media mengeras, cawan petri diinkubasi pada inkubator dalam keadaan terbalik selama 3 hari dengan suhu 28-30ºC. Setelah diinkubasi selama 3 hari dilakukan pengamatan pada jamur yang tumbuh pada media. Keberadaan jamur pelarut fosfat ditunjukkan dengan terbentuknya daerah bening (holozone) yang mengelilingi koloni jamur. Koloni tersebut kemudian dimurnikan pada media baru dan dipindahkan ke tabung reaksi yang berisi media Pikovskaya, disimpan pada suhu 4°C untuk pengujian selanjutnya.
3. Uji potensi pada media padat
Jamur pelarut fosfat yang murni selanjutnya diuji kemampuannya melarutkan fosfat dalam cawan petri berisi media Pikovskaya padat steril. Bahan yang digunakan dalam pembuatan media uji ini sama dengan bahan media Pikovskaya pada tahap isolasi, namun Ca3(PO4)2 g/L pada media isolasi diganti dengan AlPO4, FePO4, dan Batuan fosfat (RP) dengan dosis 5 g/L media. Media uji dimasukkan dalam cawan petri dan dibiarkan mengeras. Selanjutnya biakan murni ditumbuhkan pada media uji. Tiap biakan murni diberi 3 ulangan untuk mendapatkan rataan hasil yang valid. Inkubasi dilaksanakan selama 7 hari. Jamur pelarut fosfat yang membentuk holozone paling cepat dengan diameter paling besar secara kualitatif di sekitar koloni menunjukkan besar kecilnya potensi jamur pelarut fosfat dalam melarutkan unsur P dari bentuk yang tidak terlarut. Dihitung
potensi jamur dengan menggunakan nilai indeks pelarutan yaitu nisbah antara diameter zona jernih terhadap diameter koloni (Premono, 1998).
4. Uji potensi pada media cair
Jamur pelarut fosfat yang terpilih selanjutnya diuji kemampuannya melarutkan fosfat pada media Pikovskaya cair. Pengujian menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial dengan tiga kali ulangan dan dua faktor perlakuan.
a. Faktor yang diuji adalah jamur pelarut fosfat sebagai faktor pertama yang terdiri atas, yaitu:
J1 = isolat 1 J2 = isolat 2
J3 = isolat 3
b. Faktor kedua yaitu sumber P pada media Pikovskaya cair terdiri dari: P1 = Ca3PO4
P2 = AlPO4
P3 = FePO4 dan P4 = Batuan fosfat (RP Sehingga diperoleh kombinasi perlakuan adalah sebagai berikut :
J1P1 J2P1 J3P1 J1P2 J2P2 J3P2 J1P3 J2P3 J3P3 J1P4 J2P4 J3P4
Dengan demikian jumlah perlakuan (4 x 3) x 3 = 36 satuan percobaan. Model linier Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial yang digunakan dalam percobaan ini adalah sebagai berikut :
Yij = µ + αi + βj + (αβ)ij + ɛ ij Keterangan :
Yij = Nilai pengamatan pada percobaan ke-k yang memperoleh perlakuan taraf ke-i dari faktor A dab taraf ke-j dari faktor ke B
µ = Nilai tengah umum
αi = Perlakuan faktor A pada taraf ke-i βj = Perlakuan faktor B pada taraf ke-j
(αβ)ij = Pengaruh interaksi dari faktor A ke-i dan faktor B ke-j
ɛ ij = Galat percobaan dari satuan percobaan ke-k pada kombinasi taraf ke-i faktor A dan taraf faktor B.
Untuk mengetahui pengaruh dari setiap perlakuan maka akan dilakukan analisis sidik ragam (Anova). Apabila Fhitung nyata atau sangat nyata maka dilanjutkan dengan uji lanjutan berdasarkan uji jarak Duncan (Duncan Multiple Range Test).
Prosedur uji potensi pada media cair
Sebanyak 50 ml media Pikovskaya cair ditempatkan dalam Erlenmeyer 250 ml dan sebanyak satu jarum ose biakan murni jamur pelarut fosfat diinokulasikan pada media cair tersebut, selanjutnya diinkubasi secara diam dilakukan selama 7 hari pada suhu kamar. Setelah proses inokulasi selesai, kultur disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit sampai terjadi pemisahan antara filtrat dengan endapan jamur pelarut fosfat. Diambil filtrat dengan menggunakan pipet untuk mengukur kandungan P tersedia. Filtrat ditentukan kadar P-tersedianya dengan metode kolorimetri dan dihitung dengan Bray-2. Setelah itu,
digunakan pH meter untuk mengetahui pengaruh pelarutan fosfat oleh jamur terhadap pH media.
6. Identifikasi jamur pelarut fosfat yang potensial melarutkan fosfat
Setelah diperoleh jamur pelarut fosfat paling potensial selanjutnya dilakukan identifikasi pada jamur tersebut. Biakan murni jamur diremajakan pada media potato dextrose agar (PDA) dan diinkubasi selama 3 hari. Jamur yang telah tumbuh pada media, diamati ciri-ciri makroskpisnya, yaitu ciri koloni seperti sifat tumbuh hifa, warna koloni dan diameter koloni. Jamur juga ditumbuhkan pada kaca objek yang diberi potongan PDA yang dioles tipis dengan spora JPF potensial. Potongan agar kemudian ditutup dengan kaca objek. Biakan pada kaca objek ditempatkan dalam cawan petri yang telah diberi pelembab berupa kapas basah. Biakan pada kaca diinkubasi selama 3 hari pada kondisi ruangan. Setelah masa inkubasi, jamur yang tumbuh pada kaca preparat diamati ciri mikroskopisnya yaitu ciri hifa, tipe percabangan hifa, serta ciri-ciri konidia dibawah mikroskop. Ciri yang ditemukan dari masing-masing jamur kemudian dideskripsikan dan dicocokkan dengan buku indentifikasi jamur (Gilman, 1971).