Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada Juli-Oktober 2017 di Laboratorium Terpadu Universitas Prima Indonesia (UNPRI) Medan, Laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan USU, Laboratorium Research and Departement, PT. Multimas Nabati Asahan, Sumatera Utara.
Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah biji labu kuning komersil dengan varietas Guang Ban Zhong dari Cina, MZEV merk Selva dan olein sawit merk Family. Bahan kimia yang digunakan adalah n-heksana teknis, alkohol 95% netral, asam asetat glasial (Merck), kloroform (Merck), larutan KI jenuh (Merck), Na-thiosulfat (Merck), larutan indikator kanji/pati, ester metil asam lemak (Fatty Acid Metyl Ester), 21,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Sigma-Aldrich), akuades, Na2CO3, larutan Folin Ciocialteu (Merck), NaOH, indikator PP, larutan p-anisidin, etanol 95%, BF3, asam galat (Sigma-Aldrich), bipiridin (Merck), toluen (Merck), FeCl3 (Merck).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Gas Chromatography (GC) merk HP-5890 (Hewlett-Packard, Waldborn, Jerman), Spektrofotometer UV-VIS model Smart Plus Spectrophometer nomor serial 273 BR 07090 merk Bio Rad, oven, rotary evaporator, blender, alat-alat gelas untuk analisa kimia, refrigerator, burret, penangas air, dan tabung reaksi.
25
Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap sebagai berikut:
Tahap pertama : persiapan sampel serbuk biji labu kuning, selanjutnya dilakukan proses ekstraksi dan pengamatan karakteristik MBLK dengan parameter komposisi asam lemak, bilangan iodium, total kandungan fenol, total tokoferol, dan aktivitas antioksidan yang dibandingkan dengan MZEV dan olein sawit. Analisa dilakukan secara duplo untuk memastikan akurasi data.
Tahap kedua : pengujian stabilitas MBLK dengan simulasi proses pemanasan pada suhu 130oC untuk mempercepat reaksi kerusakan minyak.
Penelitian tahap ini dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor, yakni lama pemanasan (t) dengan 4 taraf yaitu 0 jam (t1),12 jam (t2), 24 jam (t3), dan 36 jam (t4), dan jenis minyak (D) yang terdiri dari 3 jenis minyak yaitu MBLK (D1), MZEV (D2), olein sawit (D3). Analisa dilakukan secara duplo dengan jumlah total sampel 24 buah untuk memastikan akurasi data.
Model rancangan acak lengkap (RAL) faktorial yang digunakan adalah sebagai berikut:
Yijk = µ+ αi + βj + (αβ)ij + εijk
dimana:
Yijk = hasil faktor A perlakuan ke-i, faktor B perlakuan ke-j pada ulangan ke-k
µ = rataan umum
αi = pengaruh perlakuan ke-i dari faktor A (lama pemanasan) βj = pengaruh perlakuan ke-j dari faktor B (jenis minyak)
(αβ)ij = pengaruh interaksi antara A dan B pada faktor A perlakuan ke-i, faktor B level ke-j
εijk = galat percobaan untuk faktor A perlakuan ke-i, faktor B perlakuan ke-j pada ulangan ke-k
Data dianalisis dengan analysis of variance (ANOVA) dan akan dilakukan uji lanjut dengan uji Duncan (DMRT) menggunakan SPSS 16.0.
Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan tahap pelaksanaan meliputi : 1) pembuatan serbuk biji labu kuning, 2) ekstraksi MBLK, 3) karakterisasi MBLK, 4) pengujian stabilitas MBLK.
Pembuatan Serbuk Biji Labu Kuning
Biji labu kuning kering dihancurkan menggunakan blender, lalu simpilisia disaring menggunakan ayakan menjadi serbuk biji labu kuning.
27
Ekstraksi Minyak Biji Labu Kuning (Rustina, 2016)
Minyak dari biji labu kuning diekstrak dengan metode maserasi. Sampel sebanyak 500 g tepung biji labu kuning diekstrak menggunakan pelarut n-heksana sebagai pelarut sebanyak 2 L (1:4) selama 5 hari dan diaduk setiap dua hari sekali, maserat kemudian disaring dengan kertas saring hingga benar-benar jernih.
Ampasnya diremaserasi selama 2 hari dengan pelarut n-heksana teknis sebanyak 1 L. Sesekali maserat diaduk agar homogen dan terlarut sempurna. Ekstrak cair yang diperoleh kemudian dievaporasi menggunakan rotary evaporator. Minyak ditempatkan di dalam botol gelap dan disimpan dalam refrigerator pada suhu 0-40C sampai dibutuhkan untuk analisa. Apabila minyak akan dianalisa, maka terlebih dahulu minyak dipindahkan dari tempat penyimpanan dan didiamkan pada suhu ruang sampai semuanya mencair. Diagram alir proses ekstraksi minyak biji labu kuning dapat dilihat pada Lampiran 1.
Karakterisasi Minyak Biji Labu Kuning
Penetapan Komposisi Asam Lemak (AOCS, Ce 1a-13) Persiapan sampel (AOCS, Ce 2-66)
Minyak yang akan diuji dimasukkan ke dalam 50 mL labu ukur sebanyak 100-250 mg. Sampel kemudian ditambahkan 4 ml 0,5 M natrium hidroksida dan dilakukan pemanasan pada larutan tersebut selama 10 menit. 5 mL larutan BF3 -metanol melalui kondensor. Selanjutnya sampel yang telah tercampur dikocok dan dipanaskan selama 2 menit. Sampel tersebut ditambahkan 2-5 mL heptana melalui kondensor, kemudian dilanjutkan dengan mengocok sampel. Lalu sampel
ditambahkan sekitar 15 mL larutan natrium klorida jenuh. Campuran sampel dimasukkan ke dalam labu ukur, lalu dikocok dengan kuat selama 15 detik.
Setelah sampel tercampur sempurna ditambahkan natrium sulfat anhidrat ke dalam larutan sampel. Larutan heptan yang telah kering disuntikkan secara langsung ke dalam GC dengan Flame Ionization Detector (FID).
Penentuan Komposisi Asam Lemak
Analisis komposisi asam lemak ketiga minyak yang diuji menggunakan Gas Chromatography (GC) yang dilengkapi dengan detektor FID dan kolom kapiler. Menginjeksikan sampel sebanyak 1µL yang mengandung 20-25 µg/mL metil ester, ekuivalen asam lemak sebesar 15-20 µg pada GC. Suhu injektor 250oC, suhu detektor 250oC, suhu oven 180oC lalu dipertahankan selama 6 menit.
Pada penentuan komposisi asam lemak ini menggunakan gas helium sebagai gas pembawa dengan tekanan 286 kPa, sedangkan tekanan gas hidrogen dan udara untuk FID masing-masing 170 kPa. Perhitungan persen luas area dengan persamaan dibawah ini yang dikalkulasikan dengan perangkat lunak yang ada pada instrumen GC.
Dimana:
Ai = luas area dari jenis asam lemak ke-i
Ai = total jumlah area di semua puncak asam lemak
29
Bilangan Iodium (AOCS Cd 1c-85 )
Penentuan bilangan iodium bertujuan untuk mengukur derajat ketidak jenuhan dengan cara mengkalkulasikan komposisi asam lemak dari masing-masing minyak yang diuji. Kalkulasi bilangan iodium untuk minyak dalam lemak atau trigliserida sebagai berikut:
Bilangan iodium (g I2/100 g) = (% asam palmitoleat (C16:1) x 0,950) + (% asam oleat (C18:1) + 0,860) + (% asam linoleat (C18:2) x 1,732) + (%
asam linolenat (C18:3) x 2,616).
Analisis Kuantitatif Kandungan Total Fenolik (Li et al., 2012)
Pembuatan Kurva Standar Asam Galat
Larutan stok asam galat dengan konsentrasi 100 mg/L dengan melarutkan 0,01 g asam galat dalam labu ukur 100 mL, lalu tambahkan akuades sampai tanda batas. Larutan stok asam galat 100 mg/L sebanyak 0,1; 0,2; 0,3; 0,4;
0,5 mL masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, dan ditambahkan dengan larutan Folin-Ciocialteu sebanyak 0,1 mL ke dalam masing-masing konsentrasi, lalu masukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Selanjutnya ditambahkan Na2CO3 7% hingga tanda batas, sehingga menghasilkan larutan standar dengan konsentrasi 1, 2, 3, 4, 5 mg/L. Masing-masing larutan didiamkan selam 30 menit, dan serapannya diukur pada panjang gelombang 750 nm menggunakan spektrofotometer UV-VIS, maka dibuatkan kurva standar dari konsentrasi yang diperoleh.
Penentuan Kandungan Total Fenolik Metode Folin-Ciocalteu (Li et al., 2012)
Sampel sebanyak 0,1 mL ditambahkan dengan 0,1 mL reagen Folin-Ciocalteu dalam tabung reaksi dan kemudian campuran ini divortex selama 3 menit. Setelah interval waktu 3 menit, 2 mL larutan Na2CO3 7% ditambahkan.
Selanjutnya campuran disimpan dalam ruang gelap selama 30 menit. Absorbansi sampel dibaca dengan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 750 nm. Hasilnya dinyatakan sebagai ekuivalen asam galat (mg GAE/g minyak).
Perhitungan total kandungan fenolik ada pada Lampiran 5.
Penetapan Kandungan Total Tokoferol (Wong et al., 1988)
Sampel dilakukan penimbangan sebanyak 100 mg, lalu sampel dimasukkan ke dalam labu ukur. Sampel yang telah ditimbang selanjutnya ditambahkan 5 ml toluen dengan menggunakan pipet tetes. Lalu sampel larutan ditambahkan 3,5 ml 2,2 bipyridine, 0,5 ml FeCl3 dan 10 ml etanol 95%, didiamkan larutan tersebut selama satu menit dan diukur pada panjang gelombang 520 nm dengan menggunakan sprektrofotmeter UV-VIS. Larutan selanjutnya dihindarkan dari sinar matahari selama pengukuran berlangsung. Kurva kalibrasi disiapkan dengan membuat larutan tokoferol yang mengandung 0-240 µg dan ditambahkan 10 ml toluene. Kurva standar tokoferol dapat dilihat pada Lampiran 2.
31
Total kandungan tokoferol dapat dihitung dengan rumus:
dimana :
A = absorbansi sampel B = absorbansi blanko
M = gradien absorbansi pada kurva kalibrasi tokoferol (0,002) W = berat sampel (g)
Penetapan Aktivitas Antioksidan (Li et al., 2009)
Aktivitas antioksidan dianalisis berdasarkan kemampuannya menangkap radikal bebas menggunakan 2,2-diphenyl-1-picrylhydroxyl (DPPH). 0,5 mL sampel ditambahkan ke dalam 2 mL larutan DPPH 0,1 mM dalam etanol.
Berubahnya warna larutan dari ungu ke warna kuning menunjukkan efisiensi penangkapan radikal bebas. Selanjutnya pada lima menit terakhir menjelang 30 menit, absorbansi diukur pada λ = 517 nm dengan spektrofotometer. Aktivitas penangkalan radikal bebas dihitung sebagai persentase berkurangnya warna DPPH dengan menggunakan persamaan.
Pengujian Stabilitas Minyak
Pengujian stabilitas minyak dilakukan dengan analisa kadar air, bilangan peroksida, bilangan anisidin, bilangan total oksidasi dan asam lemak bebas dengan membandingkan MBLK dengan 2 jenis minyak nabati lainnya yaitu MZEV dan olein sawit. Adapun metode pengujian stabilitas MBLK dengan simulasi proses pemanasan pada suhu 1300C untuk mempercepat reaksi kerusakan minyak. Pada pengujian stabilitas ini dilakukan dengan menggunakan lama pemanasan (t) dengan 4 taraf yaitu 0 jam (t1),12 jam (t2), 24 jam (t3), dan 36 jam (t4), dan jenis minyak (D) yang terdiri dari 3 jenis minyak yaitu MBLK (D1), MZEV (D2), olein sawit (D3). Analisa dilakukan secara duplo agar didapat data yang akurat.
Penentuan Kadar Air (AOCS Ca 2c-25)
Penentuan kadar air ini dilakukan berdasarkan metode AOCS Ca 2c-25.
Cawan kosong dikeringkan dalam oven pada suhu 1050C selama satu jam, lalu cawan kosong tersebut didinginkan ke dalam desikator. Kemudian sampel ditimbang sebanyak 10g ke dalam cawan. Cawan yang telah berisi sampel dimasukkan ke dalam oven selama 6 jam. Kontak antara cawan dengan dinding oven harus dihindarkan. Setelah selesai dipanaskan, cawan dipindahkan untuk didinginkan ke dalam desikator. Selanjutnya cawan berisi sampel yang telah dingin ditimbang, kemudian cawan berisi sampel dikeringkan kembali ke dalam oven sampai memperoleh berat yang tetap. Perhitungan kadar air menggunakan rumus:
33
dimana :
A : berat sampel setelah di oven B : berat sampel sebelum di oven
Penetapan Kadar Asam Lemak Bebas (AOCS, Ca 5a-40)
Sampel ditimbang sebesar 10 g dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 mL, selanjutnya ditambahkan 25 mL alkohol 95% netral dan dipanaskan selama 10 menit dalam penangas air sambil diaduk, lalu ditambahkan 2 mL indikator PP.
Campuran tersebut dikocok dan dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai muncul warna merah jambu dan tidak hilang selama 30 detik. Penetapan kadar asam lemak bebas (ALB) digunakan rumus sebagai berikut:
dimana:
% ALB = kadar asam lemak bebas mL NaOH = volume titrasi NaOH (mL) N NaOH = normalitas NaOH
G = berat sampel (gram)
BM = berat molekul asam linoleat di MBLK (280,44 g/mol) = berat molekul asam oleat di MZEV (282,46 g/mol)
= berat molekul asam palmitate di Olein Sawit (256,42 g/mol)
Penetapan Bilangan Peroksida (AOCS, Cd 8-53)
Sampel sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam erlenmeyer tertutup dan ditambahkan 30 ml pelarut campuran asam asetat glasial : kloroform (3:2 v/v).
Setelah minyak larut sempurna ditambahkan 0,5 ml larutan KI jenuh dan dibiarkan 1 menit sambil dikocok, kemudian ditambahkan 30 ml aquades. Iodium yang dibebaskan oleh peroksida dititrasi dengan larutan standar natrium tiosulfat (Na2S2O3) 0.1 N dengan indikator pati sampai warna kuning hilang. Bilangan peroksida dinyatakan dengan rumus perhitungan sebagai berikut:
dimana:
B = volume titrasi blanko (mL) S = volume titrasi sampel (mL) N = normalitas larutan Na-thiosulfat
Penetapan Bilangan Anisidin (AOCS, Cd 18-90)
Pengujian nilai anisidin diperlukan dua nilai absorbansi dari dua larutan uji yang berbeda. Larutan uji 1 dibuat dengan cara melarutkan 1 g sampel ke dalam 25 mL trymethylpentane. Larutan uji 2 dengan cara menambahkan 1 mL larutan p-anisidin (0,25 g/100 mL) ke dalam 5 mL larutan uji 1, kemudian dikocok dan dihindarkan dari cahaya. Larutan referensi dibuat dengan cara menambahkan 1
35
mL larutan p-anisidine (0,25/100 mL) ke dalam 5 mL larutan trymethylpentane, dikocok dan dihindarkan dari cahaya. Nilai absorbansi larutan uji 1 diukur pada 350 nm. Larutan uji 2 diukur pada λ = 350 nm tepat 10 menit setelah larutan disiapkan. Bilangan anisidin ditetapkan dengan persamaan berikut:
dimana:
A1 : Absorbansi larutan uji 1 A2 : Absorbansi larutan uji 2
G : Massa sampel yang digunakan pada larutan uji 1 (g)
Penetapan Bilangan Total Oksidasi (Totoks) (AOCS Cd 18-90)
Bilangan total oksidasi (Totoks) ditetapkan dengan metode AOCS Cd 18-90 dengan persamaan:
dimana:
PV : Bilangan Peroksida (mek O2/kg minyak) AnV : Bilangan Anisidin
Gambar 8. Diagram alir prosedur penelitian karakteristik dan stabilitas MBLK Biji Labu Kuning Kering
Penghalusan (Blender)
Ekstraksi Serbuk Biji Labu Kuning (Maserasi)
MBLK
Pemanasan MBLK pada suhu 130oC selama:
1. 0 jam 3. 24 jam 5. Bilangan Total Oksidasi
Pembandingan Stabilitas MBLK dengan:
1. MZEV 2. Olein sawit