Pembuatan serbuk akar pasak bumi (Gambar 11) dilakukan di laboratorium Hewan Coba dan Toksikologi Puslitbang Biomedis dan Farmasi Depkes Jakarta. Sumber akar tanaman pasak bumi diperoleh dari pasar jamu di Banjarmasin yang berasal langsung dari hutan-hutan di provinsi Kalimantan Selatan sehingga terjamin keasliannya. Tempat pemeliharaan tikus putih dan perlakuan pasak bumi dilakukan di kandang Laboratorium Patologi FKH IPB Bogor. Pengamatan tingkah laku dan pembuatan preparat sitologi cheking estrus tikus betina dengan cara vaginal smears dilakukan di Laboratorium Histologi FKH IPB Bogor.
33
Gambar 11 Akar kering pasak bumi. A. Akar tanpa kulit
B. Potongan akar untuk digiling C. Serbuk pasak bumi
Bahan Penelitian
Hewan coba berupa tikus putih jantan dewasa Rattus norvegicus strain Sprague Dawley berumur 3 ½ bulan dengan bobot 121-194 g. Sebelum diberi perlakuan pasak bumi, tikus putih diadaptasikan di kandang percobaan selama 2 minggu. Selama penelitian tikus putih diberi pakan dan minum ad libitum. Sejumlah 20 ekor tikus jantan dibagi dalam empat kelompok, yaitu: kelompok 1 (dosis seduhan 18 mg/200 g bobot badan (bb)), kelompok 2 (dosis seduhan 100 mg/200 g bb), kelompok 3 (dosis seduhan 200 mg/200 g bb), dan kelompok 4 ( kontrol, 1 ml aquades/200 g bb). Setiap kelompok terdiri atas 5 ekor tikus sebagai ulangan. Hewan penggoda libido digunakan satu ekor tikus betina yang sedang estrus dipilih dari sejumlah 6 ekor tikus betina dengan umur dan strain yang sama. Tikus diperoleh dari laboratorium hewan coba Badan Pengawasan Obat dan Makanan (POM) di Jakarta.
Akar tanaman pasak bumi (Eurycomae longifolia Jack) diproses mengikuti cara Pratomo (1987) dan Depkes (2003) yang dimodifikasi sebagai berikut: dikuliti, bagian kayu dicuci bersih lalu ditiriskan dan dipotong-potong dengan ukuran panjang 7 cm, lebar 2 cm dan tebal 2 cm. Potongan dikeringkan
34
dalam oven pada suhu 50º C selama lima hari, selanjutnya dipotong kecil-kecil menggunakan pisau stainless tajam. Potongan akar kayu tersebut lalu digiling sampai halus menggunakan alat giling khusus untuk membuat tepung merk Wiley mill USA, lalu diayak dengan pengayak Mesh 50. Simplisia selanjutnya dimasukkan ke dalam kemasan kaca kedap udara disimpan di lemari kering. Determinasi mikroskopik serbuk akar pasak bumi juga dilakukan menggunakan pewarna Giemsa 10 % tampak pada Gambar 12.
Gambar 12 Gambaran mikroskopik serbuk pasak bumi : 1. Granula tepung, 2. Trachea, 3. Parenchyma, 4. Serat, 5. Sel batu.
Disain Kandang Pengamatan Tingkah Laku
Kandang pengamatan berupa kandang plastik berukuran panjang 44 cm, lebar 34 cm, tinggi 17 cm yang berlubang-lubang di keempat sisi dan atapnya. Kandang pengamatan disekat di bagian dalam dengan kawat jaring. Tikus betina penggoda diletakkan di dalam bagian ruang kecil (14 cm x 34 cm x 17 cm) sedangkan tikus putih jantan dimasukkan di bagian yang lebih luas (30 cm x 34 cm x 17 cm). Rancangan kandang seperti itu dapat mengakomodasi: 1). keleluasaan gerak tingkah laku tikus, 2). keleluasaan indra penglihatan dan penciuman tikus dengan lingkungan di sekitar dalam dan luar kadang. 3). Tingkah laku libido/seksual tikus ♂ keinginan kawin yang meningkat ketika terangsang betina estrus, tetapi tidak dapat melakukan kawin karena disekat jaring
2 1
4
3
35 kawat. 4). tidak terjadi ejakulasi karena dibutuhkan untuk pengukuran lanjutan kualitas semen/spermatozoa, dan 5). penghematan penggunaan kelompok tikus betina, karena tidak sampai terjadi perkawinan sehingga tidak terjadi fertilisasi dan kebuntingan, tetapi tetap mendapatkan tingkah laku khusus yang mencerminkan libido tikus jantan.
Pengamatan Tingkah Laku Libido Tikus Putih Jantan
Kajian tingkah laku libido tikus putih jantan dilakukan dengan pengamatan visual di siang hari, keadaan ruangan dibuat agak remang tanpa sinar lampu tetapi tingkah laku tikus jantan dapat diamati secara visual. Hal ini dilakukan untuk menghindari biasnya data karena tikus adalah hewan nokturnal; yang tanpa pemberian apapun akan aktif pada malam hari. Setelah diberi seduhan pasak bumi peroral pada pukul 9.00. WIB, setelah selang waktu 5 jam kemudian tingkah laku diamati per individu pada pukul 14.00 WIB selama 10 menit. Selama pengamatan berlangsung tidak disediakan pakan dan minum di dalam kandang. Data tingkah laku setiap tikus yang diberi perlakuan dicatat dalam lembar pengamatan frekuensi tingkah laku. Pengamatan tingkah laku libido tikus jantan dilakukan pada hari ke-1, 2, dan 3. Ulangan perlakuan setiap variasi dosis dilakukan sebanyak 5 kali. Sebagai kontrol digunakan aquades dengan volume sama per oral. Sebagai pemicu tingkah laku libido digunakan tikus betina estrus penggoda yang ditetapkan dari enam tikus betina yang telah dipersiapkan.
Pemeriksaan Status Reproduksi Tikus Betina
Observasi fase estrus selalu dilakukan untuk mendapatkan tikus betina estrus dari enam tikus betina yang digunakan untuk penggoda (teaser) tanggapan libido tikus jantan. Metode pemeriksaan status estrus mengikuti cara standar
vaginal smears di laboratorium. Status estrus tikus betina dilakukan dengan memperhatikan ciri-ciri yang tampak di bawah mikroskop, yaitu fase sebagai berikut 1. Proestrus: didominasi oleh sel epitel berinti dan tidak berkornifikasi/lapisan tanduk, terdapat leukosit/monosit dengan frekuensi sedikit 2. Estrus: semua sel yang tampak adalah sel-sel epitel mengalami kornifikasi/lapisan tanduk. 3. Met-estrus: tampak sel-sel epitel berkornifikasi,
36
dikombinasikan dengan leukosit yang relatif banyak/ di antara sel-sel epitel tersebut. 4. Diestrus: didominasi oleh leukosit/monosit, tampak sedikit sel epitel berinti tidak berkornifikasi. Tampilan sitologi fase estrus terdapat pada Gambar 13.
Gambar 13 Tampilan sitologi fase estrus (pembesaran: 100 X). Sel-sel epitel
vagina mengalami kornifikasi (a), pada fase ini tikus betina siap untuk kawin dan mengeluarkan senyawa vaginal feromon.
Penyiapan Seduhan Pasak Bumi
Fraksi air seduhan pasak bumi berupa: aquades setelah dipanaskan 80ºC didiamkan 1 menit lalu ditambahkan ke serbuk pasak bumi dengan dosis tertentu (18 mg/200 g bb, 100 mg/200 g bb, 200 mg /200 g bb per 1 ml aquades). Setiap dosis disiapkan secara terpisah, lalu diaduk merata dan didiamkan sampai dingin. Selanjutnya supernatan dipisahkan untuk digunakan dalam penelitian.
Pemberian Pasak Bumi Dosis Seduhan 1, 2, 3
Pemberian pasak bumi dilakukan menggunakan sonde satu kali sehari peroral selama tiga hari dengan variasi dosis seduhan (18 mg/200 g bb, 100 mg/200 g bb, 200 mg /200 g bb) dan kontrol (aquades) sesuai kelompok dosis pada pagi hari pukul 9.00 WIB. Terdapat empat kelompok perlakuan (setiap kelompok terdiri atas 5 ekor tikus sebagai ulangan) sebagai berikut: kelompok 1 (dosis seduhan 18 mg/200 g bb), kelompok 2 (dosis seduhan 100 mg/200 g bb),
a
a
a
a a
37 kelompok 3 (dosis seduhan 200 mg/200 g bb), dan kelompok 4 (kelompok kontrol=1 ml aquades/200 g bb).
Dosis seduhan 1 serbuk pasak bumi 18 mg/200g bb (=90 mg/kg bb tikus) yang digunakan adalah konversi dosis yang dipakai masyarakat dalam buku tanaman obat tradisional, yaitu untuk pria dewasa: satu gram pasak bumi ditambah air seduhan sejumlah 100 ml sehari sekali selama tiga hari (Soedibyo 1998, Kardono et al. 2003, Biotech 2007). Dosis seduhan 2, yaitu 100 mg/200 g bb di dalam 1 ml aquades adalah dosis yang menimbulkan efek peningkatan libido tikus jantan tua (Ang et al. 2004). Dosis seduhan 3, yaitu 200 mg/200 g bb adalah 2 kali dosis seduhan 2 sebagai dosis yang maksimal kekentalannya setelah ditambah dengan aquades sampai 1 ml. Sebagai kontrol, diadakan perlakuan dengan pemberian 1 ml aquades per oral.
Analisis Data
Dosis terbaik dari perlakuan yang diberikan akan diperoleh dengan membandingkan mean (rerata) dari frekuensi tingkah laku libido/libido berdasarkan perlakuan dosis seduhan 1=18 mg/200 g bb, 2=100 mg/200 g bb, 3=200 mg/200 g bb, dan kontrol=aquades 1 ml pada hari ke-1, 2, dan 3. Mean
frekuensi tingkah laku libido yang tertinggi dari semua pengamatan pada hari ke-1, 2, 3 menunjukkan respons/tanggapan tingkah laku libido yang tertinggi berkaitan dengan pemberian dosis tersebut.
Perlakuan variasi dosis seduhan 1, 2, 3 pasak bumi dan periode hari ke-1, 2, 3 terhadap tingkah laku libido akan diuji dengan RAL faktorial dan bila ada pengaruh nyata pasak bumi akan diuji lanjut dengan uji Duncan sehingga menemukan dosis terbaik untuk libido dari variasi dosis yang diberikan.
38