3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2010 sampai Juli 2011 di Laboratorium Struktur Perkembangan Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara Medan.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah timbangan digital Preset Counter akurasi 0,01g, split 1ml dan 3 ml, jarum gavage, bak bedah, dissecting set, kaca arloji, jarum pentul, pisau silet goal, botol winkler, gelas ukur 1000ml, tube 14ml, hemositometer, counter, blender, panci, freezer sanyo, hot plate cimarec 2, kamera digital, mikroskop, cover glass, objek glass, dan kertas label.
Bahan yang digunakan adalah mencit (Mus musculus L.) jantan, Testosteron Undekanoat (TU) 1000g/4ml ( Buatan Schering AG Jerman), Coeleum ricini, NaCl 0,9% , biji pepaya (Carica papaya L.), aquabidestilata 500 ml, Vitamin C 50g.
3.3 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang didesain mengikuti Rancangan Acak Lengkap (RAL). Penelitian ini terdiri dari 7 kelompok perlakuan yang masing-masing memiliki kontrol. Setiap kelompok terdiri dari 5 ulangan (n=5). Penelitian ini berlangsung selama 36 minggu dimana pada minggu ke-0 hingga minggu ke-24 diberikan pemberian ekstrak air biji papaya ( Carica papaya L.) setiap
harinya dan Testosteron Undekanoat (TU) setiap 6 minggu sekali. Pada minggu ke-24 hingga minggu ke-36 dilakukan pemulihan dengan memberikan asupan Vitamin C setiap harinya.
Tabel 3.1 Rancangan Penelitian (RAL) Minggu Kelompok 0 6 12 18 24 30 36 Kontrol K0 (n=5) K1 (n=5) K2 (n=5) K3 (n=5) K4 (n=5) K5 (n=5) K6 (n=5) Perlakuan P0 (n=5) P1 (n=5) P2 (n=5) P3 (n=5) P4 (n=5) P5 (n=5) P6 (n=5) 3.4 Pelaksanaan Penelitian
3.4.1 Pemeliharaan Hewan Percobaan
Penelitian ini menggunakan mencit (Mus musculus L.) jantan yang sehat dan fertil serta berumur 8-11 minggu dengan berat 24-26 g sebanyak 70 ekor, mencit tersebut diperoleh dari Balai Penyidikan Penyakit Hewan Sumatera Utara Medan dan dibagi dalam kelompok perlakuan dan kontrol. Mencit diberi makan dan minum secara ad- libitum (Mangkoewidjojo & Smith, 1988). Kandang mencit dijaga kebersihan dan kenyamanannya. Penanganan hewan percobaan sesuai dengan persyaratan kode etik yang berlaku. Diantaranya penanganan dengan penuh kasih sayang, pemberian makanan yang cukup gizi dan sehat serta memperhatikan kebersihan kandangnya. Sebelum penelitian dilakukan diajukan permohonan untuk mendapatkan ethical clearance ke Komisi Etik Penelitian Hewan di Wilayah Sumatera Utara Medan.
3.4.2 Pembuatan Ekstrak Air Biji Pepaya
Prosedur ini dilakukan berdasarkan Ilyas (2001) Ekstrak air pepaya disiapkan dengan mengumpulkan buah pepaya yang berasal dari Kelurahan Kemenangan Tani, Kecamatan Medan Tuntungan, Komplek Adam Malik, Kotamadya Medan, Sumatera Utara. Biji pepaya diambil dan dikeringkan dengan inkubator dengan suhu 50oC (± 3 hari) sampai kering. Biji yang telah kering dimasukkan ke dalam blender lalu dihaluskan hingga diperoleh bubuk halus biji pepaya. Ditimbang bubuk yang telah
halus sebanyak 30g kemudian dimasukkan ke dalam bejana yang telah berisi air, selanjutnya dilakukan perebusan hingga mendidih dengan suhu 900C. Setelah mendidih hasil rebusan disaring dengan kertas saring hingga diperoleh hasil dan residu. Residu yang diperoleh direbus kembali, hingga diperoleh hasil dan residu lagi begitu seterusnya sampai residu tidak dapat dipergunakan kembali. Hasil rebusan dipanaskan hingga diperoleh reindaimen, reindaimen yang dihasilkan kemudian dilarutkan kembali dengan aquabidestilata 500ml, sesuai dengan kebutuhan penelitian. 3.4.3 Uji Skrinning Fitokimia Biji Pepaya
Uji skrinning fitokimia biji pepaya yang akan dilakukan meliputi pemeriksaan kandungan senyawa flavanoid, alkaloid, steroid dan terpenoid. Pemeriksaan senyawa ini sesuai dengan prosedur yang telah dilakukan oleh Harborne (1987) yaitu:
a. Uji Flavanoid
Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk- an ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml methanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi FeCl31%, tabung II ditetesi MgHCl, tabung III
ditetesi H2SO4 dan tabung IV ditetesi NaOH 10% . Masing – masing tabung sebanyak
3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat hasilnya. b. Uji Alkaloid
Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk- an ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml metanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Meyer, tabung II ditetesi pereaksi Wagner, tabung III ditetesi pereaksi Bouchard dan tabung IV ditetesi pereaksi Dragendorf. Masing-masing tabung sebanyak 3-5 tetes. Kemudian diamati endapan yang terbentuk dan dicatat hasilnya.
Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk- an ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml n- heksan. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO4 1%, tabung II ditetesi reagen Salkowsky
(H2SO4(p)), tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Masing – masing tabung sebanyak
3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya. d. Uji Terpenoid
Sebanyak 3g biji papaya yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan dan dimasukk- an ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml kloroform. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO4 1%, tabung II ditetesi reagen Salkowsky
(H2SO4(p)) ,tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Masing – masing tabung sebanyak
3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya.
3.4.4 Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.)
Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Biji Pepaya (Carica papaya L.) diberikan dengan membandingkan dosis pada manusia. Perbandingan berat relawan (50 kg=50.000 g) dengan mencit adalah (25 g) adalah 2000:1. Pada uji klinik digunakan 500 mg TU, maka dosis penyuntikan pada tiap ekor mencit adalah 1/2000x500 mg TU = 0,25mg TU (Moeloek et al., 2004; Ilyas, 2007). Sedangkan ekstrak air biji pepaya 30 mg/0,5ml/hari/25 g berat badan mencit (Ilyas, 2001). Interval waktu injeksi intramuskular TU 6 minggu dan pencekokan ekstrak air biji pepaya setiap hari. Kondisi penelitian terdiri dari tujuh (7) bagian perlakuan dan kontrol.
Dosis ekstrak air biji pepaya didasarkan pada dosis optimum penelitian Ilyas, dkk (2001) yakni 30 mg/0,5ml/hari/25 g BB mencit. Ulangan ditetapkan dengan rumus (t-1)(n-1) ≥ 15 (Federer, 1963), dimana t = perlakuan, dan n = ulangan sehingga didapatkan ulangan sebanyak 5 kali. Penggunaan dosis TU didasarkan pada
penelitian sebelumnya yang merekomendasikan pemakaiannya yakni 0,25 mg/25 g BB mencit/6 minggu (Moeloek et al., 2008; Ilyas, 2007).
Perlakuan penyuntikan TU dan pencekokan ekstrak air biji pepaya ditampilkan dalam bentuk skema pada Gambar 5 berikut.
