Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan dari Oktober 2005 sampai dengan Mei 2009 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi Fakultas MIPA dan Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis, Pusat Penelitian Sumber daya Hayati dan Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor.
Pengambilan Sampel Bakteri
Sampel air, sedimen, tanah dan udang diambil dari tambak udang perairan estuari di Karawang, Jawa Barat. Air diambil sebanyak 100 ml sedangkan sedimen dan tanah diambil kira-kira 100g kemudian dimasukkan ke dalam botol sampel. Semua sampel disimpan di kotak es sampai dikultur di laboratorium. Bakteri saluran pencernaan diambil dengan cara menarik usus dari bagian badan di belakang kepala, kemudian dibilas alkohol 75% selama 3 detik, diusap dengan kapas sampai kering dan digerus dalam lumpang sampai halus untuk selanjutnya diencerkan dalam larutan garam fisiologis (NaCl 0.85%). Keseluruhan tahapan kerja penelitian mulai dari tahap ini dan seterusnya dapat dilihat pada Gambar 3.
Isolasi dan Penapisan IsolatProteolitik dan Amilolitik
Media, Kondisi Pertumbuhan, dan Seleksi. Sampel bakteri diencerkan dengan garam fisiologis pada pengenceran 10-2-10-3 CFU mL-1 kemudian dipanaskan di dalam penangas air pada suhu 80 0C selama 15 menit. Sebanyak 0.1 mL sampel disebar pada media agar-agar SWC (sea water complete) 50% yang mengandung 1.5 gL-1 bakto pepton, 0.5 gL-1 ekstrak ragi dan 1.5 mL-1 gliserol dalam campuran air laut dan akuades dengan perbandingan 3:1 (Atlas 1997) kemudian diinkubasi pada suhu ruang (±28 0C). Metode ini memberi peluang bagi tertapisnya Bacillus mesofilik (Slepecky & Hamphyll 1992, Corbin 2005). Untuk deteksi aktivitas proteolitik media pengkulturan ditambah dengan 1% susu skim (AnleneTM , New Zealand Dairy Board, Selandia Baru). Bakto pepton dan ekstrak ragi tidak digunakan pada media SWC untuk menjaga agar sumber nitrogen satu-satunya adalah dari susu skim. Kultur diinkubasi pada suhu
ruang (±28 0C) selama 3-5 hari, kemudian diamati terbentuknya daerah bening di sekitar koloni. Indeks proteolitik diukur menurut cara Lim & Rahim (1987) dengan cara berikut:
X1 – X IP/IA =
X 2
2
IP/IA = Indeks aktivitas proteolitik/amilolitik X1 = Rata-rata diameter zona bening X2 = Rata-rata diameter koloni
Koloni positif proteolitik diuji silang aktivitas amilolitiknya, selanjutnya dilakukan pengamatan secara morfologi yang meliputi pengamatan ciri-ciri koloni, pewarnaan Gram dan spora. Isolat Bacillus murni disimpan di media SWC-agar miring pada suhu 4 0C. Kultur stok untuk penyimpanan yang lebih lama disimpan dalam gliserol 20% pada suhu -20 0
Pertumbuhan Isolat. Sepuluh isolat Bacillus yang memiliki kedua indeks proteolitik dan amilolitik terbesar di uji pertumbuhannya pada media SF 1.2% (komposisi 1.2% pakan udang dalam campuran akuades dan air laut, 1:3). Isolat dari kultur stok diremajakan pada media agar-agar SWC selama 48 jam pada suhu ruang. Satu lup koloni diinokulasikan ke dalam 50 mL media SWC pada erlenmeyer 250 mL. Kultur dikocok menggunakan mesin penggoyang dengan kecepatan 120 rpmselama ± 4 jam sampai mencapai kepadatan sel 10
C. Deteksi awal aktivitas amilase dilakukan dengan cara yang sama dengan protease kecuali komposisi media, susu skim diganti dengan 1% pati terlarut (Merck). Gliserol tidak ditambahkan untuk memastikan sumber karbon satu-satunya dari pati. Untuk konfirmasi, isolat-isolat yang diduga potensial diuji indeks amilolitiknya pada media agar-agar pakan udang 1% merek Manggalindo (media shrimp feed [SF]), yang dilarutkan dalam air laut dan aquades (3:1). Daerah halo dilihat dengan menetesi koloni dengan larutan Gram iodin. Isolat amilolitik positif diuji silang aktivitas proteolitiknya. Isolat-isolat yang memiliki indeks proteolitik dan amilolitik terbesar dipilih untuk seleksi selanjutnya.
8
CFU mL-1. Sepuluh mL isolat diinokulasikan ke dalam 50 mL media SF (pakan terlarut 1.2 %) dengan salinitas 2.5%, pH 7.5. Kultur diinkubasi pada suhu ruang (±28 0C)
23
dengan penggoyangan pada kecepatan 120 rpm selama 48 jam. Penghitungan jumlah unit koloni per melimeter (CFU mL-1) dilakukan dengan penyebaran 0.1 mL kultur pada media agar-agar SWC pada awal inkubasi, kemudian jam ke 24 dan 48. Penghitungan pertumbuhan sel pada waktu produksi enzim diukur dengan menghitung laju pertumbuhan spesifik (µ) :
( X2 / X0 µ = ln
( T
)
2 – T0 ) µ = laju pertumbuhan spesifik
X2 = jumlah sel tertinggi pada fase pertumbuhan logaritma X0 = jumlah sel pada awal fase pertumbuhan logaritma T2 = waktu pada saat akhir fase pertumbuhan logaritma T0 = waktu pada saat awal fase pertumbuhan logaritma
Uji Total Padatan Tersuspensi. Sebanyak 50 ml media pakan udang (SF) 1.2% dalam erlenmeyer 250 mL diatur pH nya menjadi 7.5 dengan menggunakan NaOH, kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 0C selama 15 menit. Alasan penggunaan substrat pakan udang 1.2% hanya berdasarkan uji coba. Setelah dingin substrat diinokulasi dengan 10 mL kultur isolat terpilih dengan jumlah sel 108 CFU mL-1, kemudian digoyang pada kecepatan 120 rpm pada suhu ruang (±28 0
C) selama 92 jam. Pada analisis TSS untuk isolat terpilih dilakukan inkubasi selama 96 jam dengan interval pengamatan setiap 24 jam. Untuk melihat penurunan padatan dalam media kultur dilakukan pengukuran TSS (Uchida 1997), pada kultur sesudah diinkubasi. Kontrol dibuat tanpa penambahan bakteri pada media kultur. Kertas saring terlebih dahulu dipanaskan di oven pada suhu 105 0C selama 2 jam untuk pengeringan kemudian ditimbang. Sebanyak 25 ml kultur disaring dengan kertas saring GFC (47 mm Ø circles, Whatman) dalam wadah penyaring yang dihubungkan dengan erlenmeyer bercorong. Corong erlenmeyer dihubungkan dengan pompa vakum berkekuatan 10 inHg (Millipore, USA). Setelah disaring, filtrat pada kertas saring dipanaskan dalam oven pada suhu 105 0C selama 3-5 jam atau sampai mencapai berat konstan. Nilai TSS dihitung dengan menggunakan persamaan menurut Uchida (1997):
TSS = (berat kertas saring + filtrat) – (berat kertas saring awal x) 106 mg L-1 Volume Sampel
Produksi Protease dan Amilase Ekstraseluler. Dua isolat yang memiliki indeks proteolitik dan amilolitik terbesar, pertumbuhan yang cepat dan kemampuan penurunan TSS tertinggi, dilihat karakter enzim protease maupun amilasenya. Sebanyak 10 ml kultur aktif dengan konsentrasi sel 108 CFU mL-1 diinokulasikan pada 100 ml media SF dengan pH 7.5 dan salinitas 2.5%. Kultur diinkubasi pada suhu ruang (28 0
Pengukuran Aktivitas Protease. Aktivitas protease diukur berdasarkan
metode Walter (1984) dengan modifikasi pada bufer yang digunakan. Tiga tabung reaksi disediakan untuk pengujian yang terdiri atas blanko, standar dan contoh. Kedalam setiap tabung dimasukkan substrat yang berupa 0.5 mL kasein 1%, kemudian 0.5 mL 0.01 M bufer Tris-HCl pH 7.5. Untuk sampel ditambahkan 0.1 mL ekstrak kasar enzim protease, blanko diisi dengan 0.1 mL aquades, sedangkan standar diisi dengan 0.1 mL tirosin 0.37 mmol L
C) di dalam water bath shaker dengan kecepatan penggoyangan 120 rpm. Setiap selang waktu 24 jam selama 48-96 jam diambil sampel kultur untuk pengujian aktivitas protease, amilase dan untuk penghitungan jumlah sel. Enzim ekstrak kasar diperoleh dengan cara mensentrifugasi biakan cair pada kecepatan 4.500 x g selama 10 menit. Supernatan mengandung enzim protease atau amilase ekstraseluler ekstrak kasar. Enzim ini selanjutnya digunakan untuk analisis dalam penelitian ini.
-1
. Campuran dikocok sampai homogen lalu diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Reaksi enzim dihentikan dengan penambahan 1 mL asam trikloro asetat (TCA) 10%. Untuk standar enzim ditambahkan setelah pemberian TCA. Campuran diinkubasi 10 menit pada lemari pendingin, kemudian disentrifus dengan kecepatan 8600 x g selama 10 menit. Endapan dibuang sedangkan supernatan ditambahkan 2.5 mL Na2.CO3 (0.4 M) dan 0.5 mL pereaksi Folin Cicalteau (1:2) dan dikocok kuat. Setelah didiamkan 20 menit setiap perlakuan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm (Lampiran 1). Satu unit aktivitas enzim adalah jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1 μmol tirosin per menit pada kondisi pengukuran, sedangkan aktivitas spesifik adalah unit aktivitas enzim dibagi dengan konsentrasi protein yang dikandung oleh enzim tersebut. Kadar protein protease ditentukan dengan metode
25
Bradford (1976) dengan menggunakan bovin serum albumin (BSA) sebagai protein standar pada kisaran 0.01-0.1 mg mL-1.
Pengukuran Aktivitas Amilase. Aktivitas amilase diukur menurut metode Bernfeld (1955). Campuran 1 mL enzim dalam substrat berupa 1 mL 1% pati terlarut dari kentang (Sigma) yang dilarutkan dalam bufer Tris-HCl 0.05 M, pH 7.5 diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit kemudian ditambahkan 2 mL reagen asam 3,5-dinitrosalisilat (DNS) untuk mendeteksi gula pereduksi. Kontrol dibuat dengan menggunakan komposisi yang sama tetapi enzim ditambahkan setelah pemberian DNS. Sampel dan kontrol dididihkan selama 5 menit untuk menghentikan reaksi, lalu didinginkan selama 15 menit dalam air. Gula pereduksi yang dihasilkan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm (Lampiran 2). Aktivitas enzim didapatkan dengan mengukur kosentrasi maltosa reaksi dengan persamaan regresi linear dari kurva standar maltosa. Standar maltosa digunakan pada kisaran 0-500 ppm dengan selang konsentrasi 100 ppm. Satu unit aktivitas amilase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang reaksinya menghasilkan produk setara dengan 1 µmol maltosa per menit pada kondisi pengukuran.
Karakterisasi Protease dan Amilase Isolat Terpilih
Pengaruh pH dan Salinitas terhadap Aktivitas Protease dan Amilase. Pengukuran aktivitas protease ekstrak kasar dilakukan dengan metoda yang sama dengan yang sebelumnya kecuali reaksi enzim dikondisikan pada kisaran pH 6, 7, 8 dan 9 dari hasil pengkulturan bakteri pada rentangan pH yang sama. Pengaturan pH dilakukan dengan menggunakan 0.01M bufer sitrat fosfat untuk pH 6 dan 0.01M Tris-HCl untuk pH 7, 8 dan 9. Pengaruh salintas terhadap aktivitas enzim protease dilihat dengan mengkondisikan rekasi enzim pada salinitas 1.5, 2.5 dan 3.5% dengan penambahan NaCl pada larutan untuk melarutkan substrat, untuk salinitas 0 hanya akuades digunakan sebagai pelarut. Enzim diproduksi dari kultur bakteri pada media SF 1.2% dalam campuran air laut dan aquades dengan salinitas 1.5 , 2.5, dan 3.5%. Uji pengaruh pH dan salinitas terhadap aktivitas amilase, menggunakan kondisi uji yang sama dengan yang untuk protease.
Stabilitas Protease dan Amilase. Stabilitas enzim diuji pada pH dan salinitas optimum enzim serta pada kondisi umum tambak. Untuk protease pH yang diujikan adalah pH 8 dan salinitas 0% (kondisi optimum) dan pH 8, salinitas 2.5% (kondisi umum tambak). Untuk amilase kondisi yang di ujikan adalah pH 6, salinitas 1.5% (kondisi optimum enzim) dan pH 8, salinitas 2.5% (kondisi umum tambak). Untuk uji pengaruh pH dilakukan dengan menginkubasi enzim ekstrak kasar dalam bufer dan salinitas yang sesuai pada perioda waktu tertentu (6 jam) atau sampai aktivitas enzim turun 50% atau lebih besar dari aktivitas tertinggi. Sampel enzim diukur tiap 1 jam. Untuk protease dan amilase pH 8,0 digunakan bufer Tris-HCl 0.01M, sedangkan untuk amilase pH 6.0 digunakan bufer sitrat fosfat 0.05M. Pengukuran aktivitas enzim dilakukan dengan cara yang sama dengan yang sebelumnya.
Penentuan Bobot Molekul (BM) Protease dan Amilase. Bobot molekul protein enzim protease dan amilase ekstrak kasar dari isolat Bacillus terpilih ditentukan dengan teknik SDS-PAGE (denaturing) dan Native-PAGE (nondenaturing) dari Bollag dan Edelstein (1991) dan zimografi dengan metoda dari Lacks & Springhorn (1980) dan Martinez et al. (2000). Untuk elektroforesis digunakan gel poliakrilamid dengan konsentrasi 8%-10% gel pemisah dan 5% gel penahan menggunakan piranti Mini Protean II (Bio-Rad, USA). Standar massa molekul relatif protein yang digunakan berkisaran pendek (low molecular weight, LMW) protein (Amersham-Bioscience). Pita protein terlihat jelas dengan melakukan pewarnaan terhadap gel hasil elektroforesis menggunakan coomassie brilliant blue (CBB)R-250 atau perak nitrat. Voltase listrik yang digunakan untuk elektroforesis ialah 65-75 volt selama 3.5-4 jam pada suhu ruang.
Zimografi dilakukan untuk melihat aktivitas enzim in situ pada gel yang dikopolimerisasi dengan substrat enzim. Protein yang terdenaturasi dengan adanya 10% SDS pada bufer sampel, direnaturasi dan diinkubasi untuk mengembalikan aktivitasnya. Metode zimogram protease dimodifikasi dari Lacks & Springhorn (1988). Persiapan gel sama dengan SDS-PAGE kecuali gel ditambahkan dengan 0.1% kasein (Amersham-Bioscience) untuk protease dan 0.1% pati (soluble starch, Merck) untuk amilase. Selain itu dilakukan juga penurunan konsentrasi substrat enzim yang dicampurkan dari 0.1% menjadi 0.025%. Pati yang digunakan
27
sebagai substrat sebelum digunakan dipanaskan pada 100 0
Elektroforesis dilakukan pada 2 tingkatan voltase, pertama pada voltase 30 volt, setelah 30 menit atau setelah protein terkumpul pada sumur gel, voltase ditingkatkan menjadi 100 volt (Martinez et al. 2000). Proses dilakukan di ruang berpendingin (± 4
C selama 10 menit untuk parsial hidrolisis, kemudian didinginkan.
0
C) selama 3 jam. Setelah elektroforesis gel dilepas dari cetakan dan di ukur jarak migrasi pita. Gel pada bagian marker dipisah dari gel sampel protein. Gel sampel direndam dalam larutan 2.5% triton-X100 untuk renaturasi selama 2.5 jam dan ada modifikasi dengan memperpanjang proses ini sampai 24 jam. Kemudian gel diinkubasi pada bufer Tris-HCl 0.01M, pH 7.5 pada kondisi optimum untuk reaksi enzim selama 30 menit sampai dengan 24 jam. Setelah itu untuk protease, gel direndam dengan larutan TCA 10% untuk menghentikan reaksi enzim, kemudian dibilas dengan air bebas ion dan diwarnai dengan larutan coomasie blue (CBB R-250) selama 10-15 menit kemudian dicuci dengan larutan peluntur semalam. Larutan peluntur diganti beberapakali sampai pita bening jelas terlihat dengan latar belakang biru tua sebagai tanda adanya aktivitas protease. Untuk deteksi aktivitas amilase, setelah reaksi enzim berlangsung 10 menit pada larutan bufer, gel diwarnai dengan larutan iodium Gram (15 gL-1 kalium iodida dan 15 gL-1
Identifikasi Isolat Terpilih
iodium) sambil digoyang pelan sampai terlihat pita bening dengan latar belakang coklat tua sebagai adanya aktivitas amilase, selanjutnya dibilas dengan air bebas ion.
Ciri-ciri Morfologi dan Fisiologi. Morfologi bakteri diamati dengan pengamatan koloni pada media padat, pewarnaan Gram dan spora (metode Schaeffer-Fulton). Karakter fisiologis diuji dengan menggunakan kit Microgen™ GN-ID Identification (Microgen Bioproduct, UK), dan uji pelengkap menurut Bergeys Mannual of Determinative Bacteriology (Holt et al. 1994).
Identifikasi Berdasarkan Sekuen Gen Penyandi 16S-rRNA. Ekstraksi DNA dilakukan menurut metode Murray Thompson (Cetyl Trimethyl Ammonium bromide, CTAB) (Sambrook & Russel 2001). Kultur bakteri dari hasil pengkulturan selama
18 jam (fase log) pada media Luria Bertani (LB) dengan penggoyangan berkecepatan 120 rpm, dimasukkan ke tabung mikro, disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet dicuci dengan 760 µl 10 mM bufer tris-EDTA (TE 1X), diresuspensi, kemudian ditambahkan 16 µL lisozim, di inkubasi selama 30 menit sambil dibolak- balik setiap 15 menit. Setelah itu sampel ditambahkan dengan 40 µl 10% SDS dan 8 µl proteinase-K (10 mg mL-1), kemudian diinkubasi 1 jam pada suhu 37 0C dan dibolak balik setiap 15 menit. Kemudian sampel ditambahkan dengan 100 µL CTAB pada suhu 65 0C, dibolak-balik dan diinkubasi pada suhu 65 0C selama 20 menit. Selanjutnya ke dalam sampel ditambahkan 0.5 ml chloroform:isoamilalkohol (CI) 24:1, dibolak-balik kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Bagian fase cair dipindahkan ke tabung mikro baru kemudian ditambahkan dengan 0.6 mL isopropanol dingin dan dibolak-balik hingga nampak benang-benang DNA, kmudian dibiarkan selama 20 menit pada suhu ruang. Setelah itu dilakukan sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 5000 rpm. Supernatan dibuang dan pelet ditambahkan 0.5
µL 70 % etanol dingin kemudian disentrifus 5 menit pada 5000 rpm. Etanol dibuang dan pelet DNA dikering anginkan pada suhu ruang. Kemudian pelet DNA diresuspensi dengan 25 µL ddH2O steril selanjutnya disimpan di lemari pembeku pada suhu -20 0
Amplifikasi gen 16S-rRNA menggunakan mesin Polymerase Chain Reaction (PCR) (Gene Amp PCR system 2400, Perkin Elmer, Biosystem, USA) dengan primer universal spesifik untuk bakteri (Research Biolab, Singapore) yaitu 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi et al. 1998). Sejumlah 25 µl master mix dimasukan ke dalam tabung mikro baru yang terdiri atas 15.5 µL ddH
C.
2O 2.5 µL 10x bufer, 1 µL 10 mM dNTP, masing-masing 1.25 µL primer 63f, dan 1387r, 0.5 µL Taq Pol dan 3 µL DNA template dimasukkan ke mesin PCR. Kondisi PCR adalah: pre PCR (94 0C, 2 menit), denaturasi (92 0C, 30 detik), elongasi (75 0C, 1 menit) dan post PCR (75 0C, 5 menit) dengan jumlah siklus 30. Hasil amplifikasi gen diverifikasi dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 0.7% dengan penanda DNA 1 kb lader (Promega, USA). Amplikon DNA gen 16S-rRNA akan muncul pada posisi 1.3 kb. Sampel kemudian dimurnikan (Promega, USA), untuk selanjutnya disekuen dengan DNA sequencer (ABI
29
Prism 3100-Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystem, USA) di PT. Charoen Pokphand Tbk, Jakarta Data sekuen di bandingkan dengan data di GenBank dari database The National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST) untuk mengetahui kemiripan spesies isolat uji dengan spesies Bacillus lainnya. Analisis kekerabatan (filogenetika) dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan multiple sequence alligment dengan program ClustalW dari European Biotechnology Information (EBI) (www.ebi.ac.uk/clustalw) kemudian data digunakan untuk pembuatan pohon filogenetik dengan program TreeCon (Van de Peer & Watcher 1997). Identifikasi molekuler sekuen gen 16S rRNA pada tahap terakhir dari rangkaian penelitian ini (Gambar 3).
Gambar 3 Diagram alir tahapan kerja penelitian. Uji TSS Isolasi dan penapisan
& pemilihan isolat
Karakterisasi dan identifikasi isolat
Uji aktivitas protease dan amilase Identifikasi molekuler (Sekuen gen16S rRNA) (1 isolat) Karakterisasi Enzim pH salinitas stabilitas pH stabilitas salinitas Uji fisiologi
Analisis protein (Elektroforesis) SDS-PAGE
Native-PAGE Zimografi
