Tempat dan Waktu Penelitian
Ekstraksi dan analisis sampel dilaksanakan di Laboratorium Kimia Pangan Pusat Studi Pangan dan Gizi, serta Laboratorium Kimia Pangan Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilakukan mulai bulan Januari 2006 sampai dengan Desember 2006.
Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan adalah kulit pisang kepok sebanyak 1,5 kg dan minyak ikan. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis antara lain air distilasi, kloroform, etil asetat, reagen Folin-Ciocalteu, Na2CO3, asam galat 0,5 mM, etanol, asam linoleat, dietil eter, air distilasi diionisasi, 0,02 M TBA (Thiobarbituric Acid) dan bahan-bahan lain yang diperlukan untuk analisis.
Alat yang digunakan dalam pengolahan antara lain pisau dan talenan. Alat yang digunakan untuk analisis yaitu gelas ukur, gelas piala, erlenmeyer, cawan porselein, timbangan analitik, penangas air, rotary evaporator, oven, desikator, spektrofotometer, GC-FID (Gas Chromatography-Flame Ionization Detector) dan alat-alat lain yang digunakan dalam analisis.
Metode Penelitian
Tahapan dalam penelitian ini meliputi karakterisasi kulit pisang yang akan dijadikan bahan baku ekstrak. Kemudian proses ekstraksi dilakukan dengan metode yang digunakan oleh Someya et al. (2002) dengan sedikit modifikasi. Hasil ekstraksi diuji komponen fenoliknya secara kualitatif dan dihitung total fenol yang terkandung dalam rendemen ekstrak, serta uji kualitatif klorofil. Setelah dilakukan proses pemurnian pada minyak ikan, ekstrak diuji terhadap stabilitas minyak ikan dengan penambahan tujuh konsentrasi ekstrak. Stabilitas oksidatif minyak ikan dilakukan dengan menggunakan katalis panas dan cahaya.
2
Karakterisasi dan Proses Ekstraksi Antioksidan dari Kulit Pisang serta Karakterisasi Ekstrak Antioksidan Kulit Pisang
Sebelum dilakukan proses ekstraksi antioksidan, terlebih dahulu dilakukan pengukuran total fenol dan kadar air yang terkandung di dalam kulit pisang. Hal ini dilakukan untuk perhitungan rendemen dan efisiensi ekstraksi.
Perhitungan Kadar Air (Sudarmadji et al. 2003)
Cawan porselin yang sudah bersih dikeringkan dalam oven selama 1 jam pada suhu 110 ºC, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (A gram). Sampel ditimbang sebanyak ± 3 gram dalam cawan porselin (B gram) dan dikeringkan dalam oven pada suhu 110 ºC selama 8 jam. Kemudian didinginkan dalam desikator, lalu dilakukan penimbangan sampai beratnya tetap (C gram).
Kadar air dihitung dengan rumus : Kadar air = 100% ) ( ) ( x A B C B − −
Pembuatan Kurva Standard Asam Tanat
Larutan asam tanat dibuat dengan melarutkan 5 mg asam tanat dalam 50 ml aquades untuk memperoleh konsentrasi 0,1 mg/1 ml sebagai larutan stok. Dari larutan stok tersebut dipipet 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 5; 6 ml. Masing-Msing ditambahkan 2 ml reagen Folin-Ciocalteau dan ditunggu selama 5 menit. Ditambahkan 5 ml Na2CO3 5%. Volume ditepatkan menjadi 100 ml dengan aquades dan ditunggu selama 40 menit. Kemudian Absorbansi diukur pada panjang gelombang 725 nm.
Nilai absorbansi (X) pada setiap konsentrasi larutan standar asam tanat diplotkan terhadap konsentrasi standard asam tanat (Y) sehingga diperoleh sebuah persamaan
Analisis Total Fenolik (AOAC 1995)
Sampel kulit pisang mentah ditimbang sebanyak ± 3 gr kulit dan ditambahkan 25 ml etanol 95 %, dihancurkan dengan mortar. Kemudian sampel disentrifusa pada 3000 rpm selama 15 menit dan diambil supernatan. Supernatan
3
dipipet sebanyak 2 ml dan ditambahkan pereaksi Folin-Ciocalteau 2 ml didiamkan selama 5 menit. Ditambahkan 5 ml larutan Na2CO3 5% dan ditambahkan aquades hingga volume menjadi 100 ml, diaduk rata dan didiamkan selama 40 menit di ruang gelap. Kemudian dianalisis dengan spektrofotometer double beam pada panjang gelombang 725 nm. Absorbansi yang terbaca merupakan nilai y,dimasukkan ke dalam persamaan garis yang didapat dari pembuatan kurva standard asam tanat, sehingga diperoleh konsentrasi fenol (mg/ml) yang merupakan nilai X. Untuk menghitung kadar fenol sampel, nilai X (konsentrasi fenol) dimasukkan dalam persamaan.
⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ × × × = ) ( 1 ) 100 ) / ( ( ) / ( gr sampel berat ml ml mg X nilai encer FaktorPeng gr mg fenol Total
Sehingga didapat total fenol dalam satuan mg per gram sampel.
Proses Ekstraksi Antioksidan Kulit Pisang Menurut Someya et al. (2002)
Kulit pisang yang masih segar dipotong-potong kecil berbentuk kubus dan ditimbang sebanyak 600 gr. Kulit pisang didihkan dalam 1800 ml air distilasi selama 5 menit untuk menginaktifkan polifenoloksidase (Jimenez dan Garcia-Carmona dalam Kanazawa dan Sakakibara, 2000). Campuran kulit pisang dan air dihomogenasi dengan cara diblender, kemudian dipanaskan pada 90 ºC selama 2 jam dalam waterbath shaker. Hancuran kulit pisang disaring dengan kain saring dan dilanjutkan dengan kertas saring no.1 menggunakan penyaring vakum. Ekstrak air kemudian dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator pada suhu 70 ºC sampai volume menjadi 600 ml.
Ekstrak air ditambah larutan air-kloroform (1:1 v/v), dengan rincian setiap 100 ml ekstrak air ditambahkan larutan air:kloroform (300 ml), dishaker selama 30 menit, dituang ke dalam labu pemisah dan dikocok, kemudian dibiarkan hingga terjadi pemisahan. Lapisan atas yang merupakan fase air diambil dan ditambah larutan air-etil asetat (1:1 v/v), dengan rincian setiap 100 ml ektrak air dilarutkan dalam larutan air:etil asetat (300 ml), dishaker selama 30 menit, dituang ke dalam labu pemisah dan dikocok, kemudian dibiarkan hingga terjadi pemisahan. Lapisan atas yang merupakan fase etil asetat jernih dan agak berwarna kekuningan kemudian diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator, dimasukkan
4
dalam wadah bertutup yang telah ditimbang beratnya, kemudian ekstrak dikeringkan dengan gas nitrogen hingga pelarut benar-benar hilang dan didapat ekstrak berwarna kecoklatan dan agak berminyak. Ekstrak dan wadah ditimbang berat untuk perhitungan rendemen. Ektrak kemudian disimpan dalam freezer untuk analisis selanjutnya. Diagram alir dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8 Diagram proses ekstraksi antioksidan kulit pisang Evaporasi
Lapisan air
Direbus dalam 1800 ml air distilasi selama 5 menit
Homogenasi
Polifenoloksidase
Ekstraksi dengan air pada 90 oC 2 jam Ekstraksi Kloroform Kloroform Etil asetat Air Ekstraksi
Lapisan Etil asetat
N2
Etil asetat Kulit Pisang 600 gr
5
Uji Kualitatif Terhadap Kandungan Polifenol, Flavonoid dan Tanin Polifenol (Harborne 1996)
Ke dalam 1 ml ekstrak (2 mg dalam 5 ml etanol) ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5 %. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. Senyawa fenol kemungkinan terdapat dalam bentuk bebas atau dalam bentuk glikosidat.
Flavonoid (Harborne 1996)
Sebanyak 1 mg sampel yang telah kering dilarutkan dalam 2 ml kloroform, kemudian sebanyak 1 ml sampel cair ditetesi Pb-asetat. Hasil uji positif untuk flavon bila terbentuk warna jingga atau krem. Kalkon bila terbentuk warna jingga tua dan auron bila terbentuk warna merah.
Tanin (Harborne 1996)
Ke dalam 1 ml ekstrak (2 mg dalam 5 ml etanol) ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5 %. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. Kemudian ditambahkan larutan gelatin 1 %. Jika terdapat endapan putih berarti positif tanin.
Uji Kuantitatif Total Fenolik
Ekstrak yang telah di N2 dan ditimbang beratnya dilarutkan dalam 10 ml etanol PA,kemudian dikonversi untuk diambil x ml yang setara dengan ± 2 mg sampel. Sebanyak 108 µl ekstrak I dan 139 µl ekstrak II dipipet menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dikeringkan dengan N2. Ekstrak kemudian ditambahkan 2,5 ml alkohol 96 % dan divortex . Ekstrak yang telah divortex, dipipet sebanyak 2 ml (masing-masing dibuat duplo) dan ditambahkan pereaksi Folin-Ciocalteau 2 ml kemudian didiamkan selama 5 menit. Tambahkan 5 ml larutan Na2CO3 5% dan aquades hingga volume menjadi 100 ml, diaduk rata dan didiamkan selama 40 menit di ruang gelap. Kemudian dianalisis dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 725 nm. Absorbansi yang terbaca merupakan nilai y dimasukkan ke dalam persamaan garis yang didapat dari pembuatan kurva standard asam tanat, sehingga diperoleh konsentrasi fenol (mg/ml) yang merupakan nilai x. Untuk menghitung kadar fenol ekstrak, nilai X (konsentrasi fenol) dimasukkan dalam persamaan :
6 ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ × × × = ) ( 1 ) 100 ) ( ( ) / ( gr sampel berat ml fenol i konsentras X nilai encer FaktorPeng gr mg fenol Total
Sehingga didapat total fenol dalam satuan mg per gram sampel.
Identifikasi Klorofil dengan TLC (Thin Layer Chromatography)
Pemisahan komponen klorofil dilakukan dengan menggunakan plat TLC selulose. Larutan pengembang yang digunakan adalah petroleum eter ringan-aseton-n-propanol dengan perbandingan 90:10:0,45 (Harborne 1987 dalam Prangdimurti 2007). Plat diaktifkan dalam oven bersuhu 105 ºC selama minimal 45 menit. Ekstrak diaplikasikan pada plat sebanyak 20 µl kemudian dimigrasi dalam ruang gelap.
Pigmen ekstrak membentuk spot-spot terpisah pada plat TLC selulose. Spot kemudian dikerik dan dilarutkan dalam pelarut aseton, kemudian diidentifikasi pada panjang gelombang 350 nm hingga 750 nm yang merupakan panjang gelombang serapan komponen klorofil.
Proses Pemurnian Minyak Ikan
Minyak Ikan yang diperoleh pada penelitian ini masih membutuhkan proses pemurnian sebelum digunakan untuk uji stabilitas antioksidan. Dimana proses pemurnian dilakukan melalui tiga tahap yaitu degumming, netralisasi dan
bleaching.
Perhitungan Kadar Asam Lemak Bebas (Bilangan Asam)
Sebelum diproses, dilakukan perhitungan kadar asam lemak bebas pada minyak untuk menentukan jumlah soda kaustik yang akan ditambahkan dalam proses netralisasi.
Sebanyak 0,2 gram minyak ikan dimasukkan dalam erlenmeyer 250 ml, ditambah 50 ml alkohol 95 % netral. Campuran tersebut dipanaskan dalam penangas air sampai mendidih selama lebih kurang 10 menit sambil diaduk. Larutan kemudian dititrasi dengan KOH 0,1 N menggunakan indikator fenolftalein sampai terbentuk warna merah jambu yang persisten selama 10 detik.
7
Kemudian bilangan asam dihitung sebagai :
sampel berat x KOH N x KOH ml asam Bilangan = 56,1 Atau sebagai kadar asam :
G M x KOH N x KOH ml asam Kadar 10 =
dimana : G = berat sampel
M = berat molekul asam lemak yang dominan dalam minyak/lemak (rata-rata dari campuran asam lemak); untuk minyak kelapa = 205, minyak kelapa sawit = 263, asam oleat = 282 dan DHA = 328 g/mol.
Degumming
Proses degumming dilakukan dengan menambahkan NaCl 8% sebanyak 40 % dari volume minyak. Kemudian dipanaskan selam 15 menit pada suhu 70 ºC sambil diaduk. Setelah dingin lapisan air dan minyak dipisahkan dan diambil bagian minyaknya.
Netralisasi
Bagian minyak yang telah didegumming kemudian ditimbang beratnya. Dari berat minyak tersebut dihitung kebutuhan NaOH yang akan digunakan dalam proses netralisasi dengan rumus :
% NaOH = % FFA x 0,142
dimana : % FFA = didapat dari perhitungan kadar asam
Setelah diketahui berat NaOH yanga dibutuhkan kemudian NaOH dilarutkan dalam aquades untuk menghasilkan soda kaustik 20 ºBe (16,7 kg dalam 100 ml aquades).
Kemudian campuran tersebut dipanaskan selama 15 menit pada suhu 60 ºC sambil diaduk. Setelah dipanaskan, minyak didinginkan selama 5 jam atau hingga terjadi pemisahan sabun dan lapisan minyak diambil.
8
Bleaching
Minyak hasil proses netralisasi dihitung beratnya dan ditambahkan bentonit sebanyak 6% dari berat minyak. Selanjutnya minyak dipanaskan selama 15 menit pada suhu 60 ºC dan dibiarkan hingga terjadi pengendapan bentonit. Bagian minyak siap digunakan untuk uji.
Uji Stabilitas Oksidasi Minyak Ikan dengan Katalis Panas dan Cahaya
Ekstrak yang telah ditimbang beratnya, dilarutkan dalam metanol, kemudian dicampur dengan minyak ikan sebanyak 10 ml sehingga dihasilkan tujuh konsentrasi (0; 114,30; 145,04; 285,75; 362,38; 571,50; 724,75 ppm). Kemudian campuran minyak dan antioksidan distrirer sambil dihembuskan gas N2 agar pelarut metanol hilang. Cara pencampuran minyak dan ekstrak antioksidan seperti ini juga dilakukan oleh Abdalla dan Roozen (2001). Sampel dengan tujuh konsentrasi ekstrak diletakkan dalam botol gelas dan dibungkus dengan aluminium foil sebanyak 14 sampel (tujuh konsentrasi ekstrak dengan dua ulangan)dan dioksidasi dalam oven dengan menggunakan panas (40 oC) yang diasumsikan sebagai panas pengeringan ikan selama 24 jam dengan alat pengeringan. Sedangkan 14 sampel lainnya dioksidasi dengan intensitas cahaya 1500-2000 lux yang dihasilkan oleh lampu fluoroscent yang diletakkan dengan jarak ±30 cm dari sampel dalam ruangan kaca dan dibiarkan selama 24 jam yang diasumsikan sebagai pengeringan dengan sinar matahari. Kemudian diukur produk oksidasi primer dengan metode diene dan triene terkonjugasi, nilai peroksida, bilangan TBA dan analisis profil asam lemak.
Pengukuran Diene Terkonjugasi (AOAC 1995)
Masing-masing minyak yang telah ditambahkan antioksidan dan dioksidasi kemudian disampling dan ditimbang beratnya, dimasukkan dalam tabung reaksi bertutup. Ditambahkan heksan sebanyak 5 ml dan divortex agar minyak larut dan tercampur rata di dalam larutan heksan. Larutan minyak dalam heksan kemudian diukur absorbansinya pada 234 nm. Kemudian dihitung konsentrasi diene berdasarkan metode AOAC (1995).
9
Cara menghitung konsentrasi diene: % Diene terkonjugasi = 0.91 x A
Dimana x
(
berat yak( )
mg ml hexan)
terukur yang absorbansi A / min 1 =
Pengukuran Nilai Peroksida (Apriyantono et al. 1989)
Pengukuran bilangan peroksida didasarkan pada jumlah iod yang dibebaskan dari potassium iodida melalui reaksi oksidasi oleh peroksida dalam lemak atau minyak pada suhu ruang di dalam medium asam asetat/ kloroform.
Sebanyak ± 0,5 gram minyak ditimbang dalam erlenmeyer 250 ml dan ditambahkan 30 ml pelarut yang terdiri dari 60 % asam asetat glasial dan 40 % kloroform, dikocok sampai semua minyak larut. Kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan potasium iodida jenuh dan didiamkan selama 2 menit di ruang gelap sambil digoyang. Ditambahkan 30 ml air destilata. Kelebihan iod dititer dengan larutan sodium tiosulfat 0,1 N atau 0,001 N tergantung dari banyaknya jumlah iod yang dibebaskan. Blanko dibuat dengan cara yang sama.
Bilangan peroksida dinyatakan dalam miliequivalen per 1000 gram sampel minyak dengan rumus :
A x N x 1000/G
Dimana : A = ml sodium tiosulfat yang dipakai contoh – ml Sodium tiosulfat yang dipakai untuk penetapan blanko.
N= Normalitas sodium tiosulfat. G= Berat contoh minyak/lemak (gram)
Uji TBA (Tarladgis et al. diacu dalam Apriyantono et al. 1989)
2-asam tiobarbiturat bereaksi dengan malonaldehid membentuk warna merah, intensitas warna merah yang terbentuk dapat diukur pada spektrophotometer.
Sebanyak 0,5 gram sampel ditimbang dengan teliti dan dimasukkan ke waring blender, ditambahkan 50 ml aquades dan dihancurkan selama 2 menit. Dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu distilasi sambil dicuci dengan 47,5 ml aquades. Ditambahkan ± 2,5 ml HCl 4 M sampai pH menjadi 1,5. Tambahkan
10
batu didih dan pencegah buih (anti foaming agent) secukupnya dan pasanglah labu distilasi pada alat distilasi. Jika ada gunakan electric mantle heater. Distilasi dijalankan dengan pemanasan tinggi sehingga diperoleh 50 ml destilat selama 10 menit pemanasan. Aduk merata distilat yang diperoleh, pipet 5 ml distilat ke dalam tabung reaksi bertutup. Tambahkan 5 ml pereaksi TBA, tutup, campur merata lalu panaskan selama 35 menit dalam air mendidih. Buat blanko dengan menggunakan 5 ml aquades dan 5 ml pereaksi, lakukan seperti penetapan sampel. Dinginkan tabung reaksi dengan air pendingin selama ± 10 menit kemudian diukur absorbansinya (D) pada panjang gelombang 528 nm dengan larutan blanko sebagai titik nol. Sampel sel yang digunakan berdiamater 1 cm. Bilangan TBA dinyatakan dalam mg malonaldehid per kg sampel.
Perhitungan TBA = 3 xabsorbansi x7,8
sampel berat
Analisis Komponen Asam Lemak pada Minyak Ikan
Sebelum analisis dilakukan, minyak ikan harus dimetilasi terlebih dahulu untuk pembentukan senyawa turunan asam lemak menjadi metil ester serta untuk memisahkan senyawa-senyawa lain. Proses metilasi dilakukan menurut metode IUPAC (1987) dalam Apriyantono (2003). Sampel minyak ditimbang ke dalam tabung reaksi bertutup dan ditambahkan satandar internal (asam margarat, C17) sebanyak 1 mg. Kemudian ditambahkan 2 ml NaOH dalam metanol 0,5 N dan dihembuskan gas N2 untuk mencegah terjadinya oksidasi lemak. Tabung reaksi dipanaskan selama 15 menit dalam waterbath dengan suhu 80 oC dan didinginkan. Kemudian ditambahkan BF3- metanol 14 % sebanyak 22 ml dan dihembuskan gas N2, dipanaskan kembali selama 15 menit dengan suhu 80 oC dan didinginkan hingga suhu 50 oC. Ditambahkan 1 ml n-heksan Chromatography Grade, dihembuskan N2 dan divortex. Selanjutnya ditambahkan NaCl jenuh sebanyak 3 ml dan divortex, dibiarkan hingga terpisah menjadi dua fase. Lapisan atas diambil (asam lemak dalam heksan) dan disaring dengan Na2SO4 anhydrous dan ditampung di vial. Metil Ester siap diinjeksikan pada gas kromatografi.
Sebelum dilakukan injeksi, gas kromatografi di-conditioning terlebih dahulu. Suhu injektor diatur pada 225 oC, suhu detektor 225 oC dan suhu kolom
11
100 oC dengan tekanan gas helium 1 kg/cm2. Detektor dinyalakan dengan tekanan udara dan hidrogen masing-masing 0,5 kg/cm2. Suhu diprogram pada 120 oC selama 6 menit kemudian dinaikkan secara gradien linier dengan kecepatan kenaikan suhu 3 oC/ menit hingga suhu mencapai 230 oC dan ditahan selama 20 menit. Sampel diinjeksikan sebanyak 1 μl dengan teknik split ratio kira-kira 1 : 30.
Setelah conditioning selesai yang ditandai dengan base line yang lurus pada kromatogram tanpa ada muncul peak-peak tertentu, diinjeksikan standar eksternal FAME Mix C8 – C22 dan sampel yang akan dianalisis.
Kromatogram yang diperoleh dari hasil analisis asam-asam lemak diidentifikasi dengan membandingkan dengan kromatogram standar eksternal. Kemudian dihitung respon faktor dari tiap-tiap asam lemak pada standar eksternal dengan rumus : 17 17 C mg x lemak asam Area lemak asam mg x C Area RF=
Asam lemak pada sampel dihitung dengan rumus :
sampel g x C Area RF x C mg x AL Area sampel g AL mg lemak asam Kadar 17 17 ) / ( = Rancangan Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen. Sedangkan rancangan yang digunakan untuk analisis adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) non faktorial dengan dua ulangan (Mattjik dan Sumertajaya 2002). Untuk melihat pengaruh perbedaan konsentrasi dan senyawa antioksidan yang digunakan dilakukan uji Duncan (BNT). Data diolah dengan menggunakan Microsoft Excel dan SPSS.