3.1. Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Pertanian, Laboratorium Pengolahan Hasil Pertanian, Laboratorium Pengawasan Mutu Hasil Pertanian Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Lampung pada bulan Februari 2016 Hingga April 2016.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang dipergunakan meliputi nanas madu yang diperoleh dari pedagang di daerah Raja Basa, kulturLactobacillus casei,air mineral, glukosa, susu skim yang dipergunakan sebagai substrat pertumbuhan, MRS Agar sebagai media tumbuh Bakteri Asam Laktat dan MRS Broth untuk pembuatan kultur, Carboxy Methyl Cellulose(CMC), akuades, PP, NaOH 0,1N, larutan NaCl, dan alkohol 70%.
Alat-alat yang digunakan terdiri dari tabung reaksi, cawan petri, incubator 37 oC, oven 60 oC, autoclave 121 oC (15 menit), lampu bunsen, neraca analitik (ketelitian 0,0001 g), pipet tip, tisu, sendok, blender, baskom, pisau, kain saring, hot plate stirrer, gelas ukur, labu Erlenmeyer, alumunium foil, mikro pipet, alat gelas lainya dan lemari pendingin atau refrigerator (5–12oC).
26
3.3. Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Kelompok Lengkap. Faktor pertama adalah konsentrasi penambahan CMC (C), perlakuan konsentrasi terdiri dari 4 taraf yaitu 1 (0%), 2 (0,1%), 3 (0,2%), dan 4 (0,3%) (b/v). Faktor kedua yaitu lama penyimpanan (M) yang terdiri dari 7 taraf, yaitu 0 hari, 7 hari, 14 hari, 21 hari, 28 hari, 35 hari dan 42 hari. Penelitian ini memiliki 28 unit perlakuan dengan menggunakan 3 ulangan dan setiap ulangan dianalisis secara duplo. Minuman fermentasi laktat yang sudah diberi perlakuan konsentrasi bahan penstabil selanjutnya disimpan pada suhu penyimpanan dingin yaitu sekitar 12 ± 5 °C selama 6 minggu, lalu dilakukan pengamatan setiap 1 minggu. Pengamatan meliputi total bakteri asam laktat, pH, total asam laktat, stabilitas minuman, dan uji organoleptik meliputi warna, aroma, rasa, dan penerimaan keseluruhan. Data yang diperoleh diuji dengan kesamaan ragam dengan uji barlett dan kemenambahan data di uji dengan uji Tuckey. Data selanjutnya dianalisis lanjut dengan Polinominal Ortogonal pada taraf nyata 5%.
3.4. Pelaksanaan Penelitian
1. Persiapan Starter
Pembuatan starter dilakukan dengan metode Rizal, dkk., (2006) yang telah dimodifikasi. Kultur bakteri yang akan digunakan dipindah ke tabung reaksi berisi MRS Broth steril, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 °C. Kemudian
27
sebanyak 40μ ditumbuhkan ke dalam susu skim 5 % (b/v) steril 10 ml. Kultur ini disebut kultur induk. Selanjutnya dari kultur induk diinokulasikan ke dalam media susu skim (5% b/v) dan glukosa (3% b/v) dalam media nanas 50 ml, dan diinkubasi selama 48 jam sehingga didapat kultur antara. Kemudian kultur antara diinokulasikan sebanyak 4% (v/v) ke dalam media susu skim 5% (b/v) dengan penambahan 3% (b/v) glukosa steril dalam media nanas 50 ml. Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 37oC, sehingga didapatkan kultur kerja. Diagram alir proses pembuatan starter dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Diagram alir persiapan starter (Rizal, dkk., 2006) yang telah dimodifikasi Kultur stok BAL
Diambil 40μ secara aseptis ke dalam masing-masing tabung yang mengandung media susu skim (5% b/v) 10 ml steril
Inokulasi kultur induk (4% v/v) dalam media nanas 50ml dengan penambahan susu skim steril (5% b/v)
Inokulasi kultur antara (4% v/v) ke dalam media nanas 50 ml dengan penambahan susu skim steril (5% b/v) dan glukosa (3% b/v)
Inkubasi (37oC, 48 jam) sehingga didapatlahkultur induk
Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam, sehingga didapatlahkultur kerja
28
2. Pembuatan Sari Buah Nanas
Buah nanas yang dipilih buah nanas madu varietas Queen yang cukup matang, berwarna kuning oranye, dan layak dikonsumsi. Buah nanas mula-mula dikupas kulitnya dan dibersihkan mata nanasnya baru dicuci. Tahap selanjutnya dilakukan penghancuran buah menggunakan blender, kemudian dilakukan penyaringan sehingga diperoleh sari buah nanas. Diagram alir pembuatan sari buah nanas dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Diagram alir pembuatan sari buah nanas (Rizal, dkk., 2006) yang telah dimodifikasi
Buah Nanas
Kulit buah dan mata nanas
Daging buah nanas
Dihancurkan
Disaring dengan kain saring
Ampas
Sari buah nanas Didiamkan selama satu jam Penambahan air
29
3. Proses Pembuatan Minuman Probiotik Sari Buah Nanas
Proses pembuatan minuman probiotik sari buah nanas diterapkan dengan metode pembuatan minuman probiotik dari kulit nanas yang dilakukan oleh Rizal, dkk., (2006). Sari buah yang didiamkan selama 1 jam dalam suhu ruang untuk memisahkan endapan selanjutnya ditambahkan susu skim dan gula sebanyak 4 % dan 2 % serta CMC sesuai perlakuan (0 %, 0,1 %, 0,2 %, dan 0,3 % (b/v). Diagram alir pembuatan minuman probiotik sari buah nanas dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Diagram alir pembuatan minuman probiotik sari buah nanas (Rizal, dkk., 2006) yang dimodifikasi
Sari Buah Nanas 240 ml Susu skim
dan gula sebanyak 4%
dan 2% (b/v) Sterilisasi (121 °C, 15 Menit)
didinginkan hingga suhu 37°C
Inokulasi 4% (v/v)L. casei
Inkubasi (37 °C, 48 Jam)
Penyimpanan suhu dingin (12 ± 5) °C selama 42 hari dan Pengamatan setiap 7 hari
CMC 0 %, 0,1 %, 0,2 %, dan 0,3 % (b/v)
Minuman probiotik sari buah nanas diamati sebagai hari ke 0
30
3.5. Pengamatan
1. Total Bakteri Asam Laktat
Pada pengamatan total bakteri asam laktat, pengamatan dilakukan setelah bakteri diinkubasi selama 48 jam. Analisis ini dilakukan dengan perhitungan cawan petri (Fardiaz, 1987). Sebanyak 1 ml sampel diencerkan dengan 9 ml larutan garam fisiologis steril. Campuran kemudian dihomogenkan dan diambil 1 ml larutan dari tabung pertama lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi kedua yang berisi 9 ml larutan garam fisiologis steril sehingga diperoleh pengenceran 10-1 dan seterusnya hingga diperoleh pengenceran 10-8 atau sampai pada pengencaran yang diinginkan . Tiga pengenceran terakhir atau dari pengenceran yang dikehendaki diambil dengan pipet 1ml, lalu sampel dimasukkan ke dalam cawan petri steril kemudian ditambahkan kira-kira 10-15 ml media MRS Agar steril. Pada isolasi BAL ini digunakan media isolasi yang spesifik yang sering disebut sebagai media selektif. Media selektif ini digunakan untuk menumbuhkan dan memelihara bakteri tertentu. Dengan sifat kekhususannya maka akan menyeleksi BAL secara langsung. Pada media ini hanya bakteri tertentu yang dapat tumbuh. Pada isolasi BAL, media yang digunakan ialah media De Man Rogosa Sharpe Agar/MRS agar (Oxoid, 1982). Cawan yang telah berisi media dan sampel ini diratakan dengan cara menggerakkan secara vertikal membentuk angka 8 dan biarkan sampai membeku, kemudian cawan diinkubasi dengan posisi terbalik untuk mencegah mikroba terkena uap air yang dihasilkan saat inkubasi, sehingga kualitas mikroba tidak rusak atau mengalami
31
gangguan. Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 48 jam lalu dihitung koloni yang tumbuh dengan menggunakan alat penghitung koloni (colony counter). Total koloni yang terhitung harus sesuai standar International Comission Microbiology Food (ICMF) yaitu yang memiliki jumlah 30-300 koloni percawan petri (Fardiaz, 1987).
2. Total Asam Laktat
Pengujian total asam laktat dilakukan berdasarkan metode Sudarmadji, dkk., (1988). Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam erlenmeyer selanjutnya diencerkan dengan 10 ml air destilat, campuran tersebut kemudian dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N. Untuk menentukan titik akhir titrasi digunakan indikator fenolftalin. Akhir titrasi tercapai setelah terbentuk warna merah muda yang konstan. Perhitungan total asam laktat dilakukan dengan rumus:
Keterangan : N = Normalitas larutan NaOH FP = faktor pengenceran = 0,1
BM asam laktat (CH3CHOHCOOH) = 90 ml sampel = 1 ml
3. Derajat Keasaman ( pH )
Nilai pH ditentukan dengan menggunakan pH meter. Pengamatan derajat keasaman dilakukan pada saat pembuatan minuman probiotik sari buah nanas selesai di
Total BAL (Koloni/ml) = Jumlah Koloni Terhitung × 1
Faktor Pengenceran
% Asam laktat = N NaOH × ml NaOH × FP × BM Asam Laktat ml Sampel
32
fermentasi. Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan pH meter. Sebelum dilakukan pengamatan, pH meter harus dikalibrasi terlebih dahulu dengan menggunakan larutan buffer 4,0 dan 7,0. Selanjutnya dilakukan pengukuran terhadap larutan sampel dengan mencelupkan elektrodanya ke dalam larutan sampel dan dibiarkan beberapa saat hingga diperoleh pembacaan yang stabil. Alat pH meter yang akan dipergunakan harus terstandarisasi sekurangnya 1 tahun sekali oleh badan pusat statitiska.
4. Stabilitas
Pengamatan stabilitas minuman probiotik buah nanas dilakukan setelah minuman probiotik ini disimpan. Stabilitas diamati setiap 7 hari sekali sampai minggu ke- 6. Analisis stabilitas diukur dengan menggunakan metode yang dilakukan oleh Sutter (Aziz, 2009). Penentuan stabilitas dilakukan berdasarkan perbandingan antara volume bagian keruh dengan volume total. Stabilitas diukur berdasarkan persen bagian keruh, dengan semakin rendah nilainya maka stabilitas akan semakin baik. Analisis dilakukan dengan cara mengukur tinggi fraksi bagian keruh dari minuman probiotik dan tinggi minuman probiotik keseluruhan besarnya stabilitas dinyatakan dalam persen. Sampel sebanyak 50 ml dimasukan ke dalam botol transparan. Kemudian diamati pemisahannya dan diukur volume awal larutan sebelum terjadi pemisahan atau pengendapan, nilai ini digunakan sebagai nilai volume larutan secara keseluruhan. Kemudian diukur bagian zat yang terpisah sebagai volume bagian keruh.
33
Perhitungan dapat dihitung dengan rumus :
5. Uji Organoleptik
Penilaian organoleptik minuman probiotik sari buah nanas dilakukan dengan uji skoring dan uji hedonik (Meilgaard, 1999) terhadap warna, aroma, rasa, dan penerimaan keseluruhan. Sebelum dilakukan uji organoleptik, minuman probiotik sari buah nanas terlebih dahulu ditambahkan larutan sukrosa 65% dengan perbandingan 1:1. Hal ini dilakukan untuk mengurangi rasa asam yang ditimbulkan oleh minuman probiotik sari buah nanas tersebut.Pengujian dilakukan oleh 25 mahasiswa sebagai panelis semi terlatih yang berada di Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung. Pada kuisioner dibuat deskripsi untuk masing-masing parameter, kemudian deskripsi akan dihitung persentasenya. Contoh kuesioner yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 4.
% Stabilitas = Volume total (a+b)–Volume bagian keruh (b) Volume total (a+b)
34
Tabel 4. Lembar Questioner Uji Skoring dan Uji Hedonik
Nama panelis : ... Tanggal : ... UJI SKORING dan UJI HEDONIK
Dihadapan saudara disajikan sampel minuman probiotik sari buah nanas yang diberi kode acak. Anda diminta untuk menilai warna, rasa, dan aroma (uji skoring) serta penerimaan keseluruhan (uji hedonik), dengan skor dari 1 sampai 5 sesuai keterangan yang terlampir.
Parameter Kode Sampel
295 112 692 403 Warna Aroma Rasa Rasa 5. Sangat asam 4. Asam 3. Agak Asam 2. Tidak asam 1. Sangat tidak asam Warna 5. Kuning jernih 4. Kuning 3. Agak kuning 2. Kuning keruh 1. Kuning sangat keruh Aroma
5. Sangat khas nanas 4. Khas nanas 3. Agak khas nanas 2. Tidak khas nanas 1 . Sangat tidak khas
nanas Rasa 5. Sangat asam 4. Asam 3. Agak Asam 2. Tidak asam 1. Sangat tidak asam
Keseluruhan 5. Sangat suka 4. Suka 3. Agak suka 2. Tidak suka 1. Sangat tidak suka
58