Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Institut Pertanian Bogor (IPB) di Laboratorium Biokimia Fakultas Teknologi Pertanian, Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Kedokteran Hewan, Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan, Klinik Farfa Darmaga dari bulan Juni 2006 sampai Maret 2007.
Bahan dan Alat Bahan
Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah bubuk kakao bebas lemak dari jenis bulk masak yang diperoleh dari Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember dan eritrosit yang diperoleh dari darah responden. Bubuk yang digunakan merupakan bubuk biji kakao varietas bulk masak non fermentasi yang memiliki total fenol dan daya proliferasi yang tinggi berdasarkan uji in vitro
(Zairisman, 2006). Bahan lain yang digunakan adalah gula pasir, air panas dan susu bubuk skim. Bahan ini juga digunakan Erniati (2007), Hasanah (2007), Yuliatmoko (2007) dan Kusumaningtyas (2007).
Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah phosphate buffer saline (PBS) (Sigma), pewarna trifan blue, NaHCO3, asam klorida, larutan standar malonaldehida (MDA) dari 1,1,3,3-tetraetoksipropana (Sigma), asam trikloro asetat, aquabides, alkohol 90%, asam tiobarbiturat, pelarut air bebas ion (Kimia Farma), KH2PO4, asam fosfat, 2,2-difenil-1-pictihidrazil (DPPH), metanol pro analisis, hidrogen peroksida (H2O2) dan formalin (CH2O).
Alat
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini antara lain: sentrifuge (Jouan, tipe CR 412), laminar air flow (Holten Laminar air tipe HV 2472), inkubator Jouan, tipe IG 150) (CO2 5%, 37ºC), mikroskop, hemasitometer (Superior),
microplate reader (BIO-RAD, Benchmark) spektrofotometer (Shimadzu),
Sedangkan peralatan sekali pakai yang digunakan adalah jarum suntik 50 ml (Terumo), jarum suntik 3 ml, tabung sentrifus steril 15 dan 50 ml (Corning), lempeng mikro 96 sumur (Corning), membrane filter 0,22 µm (Corning), dispenser tip (Marsh), tabung vacutainer ukuran 9 ml dengan koagulan, needles
vacutainer (Becton dickinson) dan gelas objek.
Diagram Alir Penelitian
Alur penelitian yang telah dilakukan digambarkan secara skema dalam diagram alir berikut:
Gambar 5 Diagram Alir Penelitian
Penentuan populasi subyek
Pengukuran status gizi
Pengambilan darah dan pemisahan komponen darah Kelompok kontrol
(K) mengonsumsi minuman susu skim,
tanpa kakao selama 25 hari
Kelompok perlakuan (P) mengonsumsi minuman bubuk kakao
selama 25 hari
Isolasi sel eritrosit
Uji sifat antioksidatif
Analisa ketahanan membran terhadap senyawa reaktif Analisa kadar MDA Analisa aktivitas antioksidan dengan metode DPPH H2O2 Formalin Persentase Hemolisis Formulasi minuman bubuk
kakao bebas lemak
Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan bersama-sama dengan Erniati (2007), Hasanah (2007), Yuliatmoko (2007) dan Kusumaningtyas (2007) mulai dari tahap formulasi minuman bubuk kakao bebas lemak sampai tahap pemisahan komponen darah.
Formulasi Minuman Bubuk Kakao
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Zairisman (2006) yang menyatakan bahwa bubuk kakao dalam jumlah tersebut dapat berfungsi sebagai imunomodulator pada sel limfosit manusia, maka pada penelitian ini digunakan 4 g bubuk kakao sebagai bahan pembuat 100 ml minuman. Bahan tambahan gula dan susu skim ditentukan dengan melakukan uji pendahuluan oleh 10 orang panelis. Adapun perbandingan variasi gula dan susu yang ditambahkan (g) antara lain: 1 : 1, 2 : 1, 1 : 2, dan 2 : 2. Hasilnya yang paling disukai adalah minuman yang terbuat dari 4 g bubuk kakao ditambah 2 g gula dan 2 g susu dalam 100 ml air hangat. Sehingga minuman dengan formula inilah yang disajikan kepada responden.
Persiapan Responden
Responden yang terlibat dalam penelitian ini adalah mahasiswi Instirut Pertanian Bogor sebanyak 18 orang yang berusia 22-27 tahun, dan bertempat tinggal di perumahan dosen, kompleks IPB II Sindang Barang. Responden yang dipilih adalah mahasiswi yang dinyatakan sehat berdasarkan hasil pemeriksaan kesehatan oleh dokter di Klinik Farfa Darmaga. Pemeriksaan kesehatan juga dilakukan setelah responden menjalani intervensi selama 25 hari (format pemeriksaan terdapat pada Lampiran 2). Responden dibagi dalam 2 kelompok yaitu kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Masing-masing kelompok berjumlah 9 orang. Kelompok perlakuan mengonsumsi minuman kakao bebas lemak. Sedangkan kelompok kontrol mengonsumsi minuman yang terdiri dari 2 gram susu bubuk skim yang ditambah 2 gram gula dan 100 ml air hangat.
Pelaksanaan Intervensi (Nurrahman 1998)
Intervansi dilakukan setiap hari pada jam 07.00-08.00 WIB selama 25 hari di rumah indekost mahasiswi di kompleks perumahan IPB II Sindang Barang. Minuman bubuk kakao disiapkan setiap hari oleh peneliti yang sekaligus mengawasi responden meminum minuman bubuk kakao. Setiap responden mendapat sarapan pagi sebelum mengonsumsi minuman bubuk kakao dan makan malam dengan menu yang seragam. Seminggu sekali selama pelaksanaan intervansi dilakukan diskusi yang melibatkan seluruh responden mengenai penelitian dan kesehatan umum.
Sebelum pelaksanaan intervansi dilakukan penandatanganan surat perjanjian
(informed consent) (Lampiran 1) dan wawancara terhadap respoden dengan
format kuisioner standar (Lampiran 2).
Pengukuran Status Gizi (Nurrahman 1998)
Pengukuran status gizi responden dilakukan secara antropometri yang meliputi tinggi badan (TB) dan berat badan (BB). Penggolongan status gizi menurut body mass index (BMI) dengan satuan kg/m2, yaitu:
BMI = BB/TB2
Dimana: BMI < 17,0 : kekurangan berat badan tingkat berat BMI 17,0-18,4 : kekurangan berat badan tingkat ringan BMI 18,5-25,0 : normal
BMI 25,1-27,0 : kelebihan berat badan tingkat ringan BMI > 27,0 : kelebihan berat badan tingkat berat
Pengambilan Darah dan Pemisahan Komponen Darah
Pengambilan darah dilakukan sebelum dan sesudah intervansi di klinik Farfa Kampus Dramaga IPB pada jam 07.00 pagi oleh seorang staf klinik yang sudah berpengalaman dalam pengambilan darah. Darah diambil menggunakan tabung vacutainer steril yang mengandung koagulan sehingga darah tidak menggumpal. Darah yang diambil segera disentifuse pada 514 x g selama 10 menit untuk memisahkan plasma, limfosit dan eritrosit.
Isolasi Eritrosit (Zhu et al 2005)
Eritrosit yang telah terpisah diambil sebanyak 1 ml kemudian dicuci tiga kali dengan 5 volume larutan PBS pH 7,4, hasilnya disuspensikan dengan 10 volume larutan PBS pH 7,4. Jumlah sel eritrosit yang ada di dalam suspensi dihitung, kemudian suspensi tersebut diencerkan dengan larutan PBS pH 7,4 hingga jumlah sel eritrosit dalam suspensi menjadi ± 5 x 105 sel/ml.
Analisa Malonaldehida (MDA) (Winarsi 2002)
Prinsip metode ini berdasarkan kemampuan pembentukan kompleks berwarna merah jambu antara MDA dengan asam tiobarbiturat (TBA). Mula-mula dibuat larutan standar MDA dari 1,1,3,3-tetraetoksipropana (TEP) dengan pelarut air bebas ion dengan konsentrasi 1,25; 1,5; 1,75; 2; 2,5 pmol/µl. Pereaksi TBA dibuat dengan melarutkan 1,728 gram TBA (asam tiobarbiturat) dalam 100 ml buffer fosfat pH 3.
Sebanyak 75 µl sampel eritrosit 5 x 105 sel/ml dan larutan standar TEP dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup, kemudian ditambahkan 75 µl TCA 20% (0,6 mol/L HCl). Setelah itu didinginkan dalam es selama 20 menit. Campuran tersebut disentrifuse pada 704 x g selama 15 menit. Sebanyak 100 µl supernatan yang diperoleh ditambahkan 20 µl TBA 120 mM dan selanjutnya campuran dididihkan selama 30 menit. Setelah didinginkan dengan air kran, campuran tersebut dimasukkan ke dalam microplate reader dan diukur absorbansinya menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 540 nm. Hasilnya dibandingkan dengan kurva standar TEP.
Analisa Antioksidan Eritrosit dengan Metode DPPH (Turkmen et al 2005) Prinsip metode ini berdasarkan kemampuan senyawa antioksidan yang terdapat pada eritrosit untuk mengikat DPPH sehingga warna ungu DPPH memudar.
Sebayak 1 ml suspensi eritrosit dengan jumlah sel 5 x 105 sel/ml yang telah dilisis dalam air deionisasi dan disimpan pada suhu -30ºC, diambil dan ditambah dengan metanol pro-analisis sebanyak 1 ml dan DPPH 0,2 mM sebanyak 1 ml, lalu divortek, kemudian disimpan di ruang gelap selama 60 menit dan diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm menggunakan spektrofotometer. Aktivitas antiradikal bebas dihitung dengan rumus:
Aktivitas antiradikal bebas (%) = [(Akontrol – Asampel)/Akontrol] x 100%
Penentuan Persentase Hemolisis (Zhu et al 2005)
Sejumlah 100 µl suspensi eritrosit 5 x 105 sel/ml dimasukkan masing-masing ke sembilan sumur lempeng mikro dan ditambahkan 100 µl PBS, 100 µl H2O2 atau 100 µl formalin masing-masing ke dalam tiga sumur, kemudian diinkubasi dalam inkubator, dan setiap 20 menit sekali diukur absorbansinya menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 540 nm. Eritrosit yang diinkubasi dengan PBS digunakan untuk mengukur total hemoglobin (Atotal) yang terkandung di dalam sel, dan eritrosit yang diinkubasi dengan H2O2 dan formalin digunakan untuk mengukur hemoglobin yang belum teroksidasi baik oleh adanya H2O2 maupun formalin (Asampel). Persentasi hemolisis disebabkan oleh H2O2 dan formalin dihitung dengan persamaan: