BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2008 sampai dengan Februari 2009 di Laboratorium Bakteriologi dan Laboratorium Bio-Molekuler Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian, Jakarta.

Isolasi dan Identifikasi Cmm dari Tanaman Tomat Bergejala Isolasi Cmm dari tanaman tomat bergejala

Tanaman tomat bergejala kanker bakteri diperoleh dari Unit Pelaksana Teknis (UPT) Karantina Teluk Bayur pada bulan Juli 2008 yang berasal dari pertanaman tomat di Kabupaten Solok, Sumatera Barat. Batang tanaman tomat bergejala disterilisasi permukaan dengan alkohol 70%, kemudian dibilas dengan akuades steril, dipotong dan ditimbang sebanyak 5 gram. Kemudian ditambah 50 ml bufer PBS dan dihancurkan dengan grinder selama 1 menit dan diinkubasi selama 6 jam pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan ke tabung steril, dan dilakukan pengenceran berseri 10⁰-10^-10. Dari setiap pengenceran dilakukan

plating pada media SCM dalam cawan petri. Kemudian diinkubasikan pada 27^oC, dan diamati setiap hari selama 14 hari.

Koloni bakteri yang diduga Cmm dimurnikan pada media YDC. Koloni bakteri yang berwarna kuning pada media YDC, dilakukan uji Gram. Koloni yang merupakan gram Positif, kemudian diidentifikasi dengan uji Biolog^TM, ELISA, dan PCR.

Identifikasi Cmm berdasarkan uji Biolog

Identifikasi koloni yang diduga Cmm dilakukan menggunakan Biolog Microlog 3^TM dengan langkah sebagai berikut: Biakan dipanen dengan cotton swab steril dan disuspensikan dalam GN/GP inoculation fluid atau akuades steril, kemudian diukur turbiditasnya dengan Biolog turbiditimeter hingga transmisi 20%. Setelah itu ditambahkan 3 tetes thioglycolate, di campur dengan hati-hati sehingga tidak terbentuk gelembung udara, kemudian suspensi dituangkan dalam cawan petri steril atau reservoir. Masing-masing lubang mikroplat GP2 diisi 150 µl suspensi bakteri, kemudian diinkubasikan pada 35-37⁰C selama 4-24 jam dan dibaca menggunakan Biolog MicroStation Reader.

12

Identifikasi Cmm berdasarkan uji ELISA

Koloni yang diduga Cmm di deteksi dengan metode serologi DAS-ELISA menurut protokol Agdia™, berturut-turut adalah sebagai berikut: antibodi poliklonal dicampur coating buffer dengan perbandingan 1:200, kemudian plat ELISA diisi sebanyak 100 µl per sumur dan diinkubasikan selama 4 jam pada suhu ruang atau semalam pada refrigerator (4 ^oC). Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), kemudian diisi dengan suspensi bakteri, bufer, kontrol negatif, dan kontrol positif, masing-masing sebanyak 100 µl per sumur sesuai lay out pengujian. Suspensi bakteri disiapkan dengan mencampur isolat dengan General extraction buffer (GEB) dengan perbandingan 1 : 10. Plat ELISA diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang atau semalam pada refrigerator (4 ^oC). Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), enzim konjugat dicampur dalam ECM buffer dengan perbandingan 1:200, kemudian dimasukkan sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 2 jam pada temperatur ruang. Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), Substrat PNP dilarutkan dalam PNP buffer dengan perbandingan 1 mg: 1 ml, kemudian diisikan dalam plat sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 15 sampai 60 menit pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan terhadap perubahan warna pada sumur. Apabila warna berubah menjadi kuning menunjukkan bakteri yang diuji positif dan apabila tetap bening menunjukkan bakteri yang diuji negatif. Pengamatan dapat dilakukan dengan membaca absorbansi pada microplate reader pada panjang gelombang 405 nm. Hasil dinyatakan positif apabila nilai absorbansi sampel ≥ 2x nilai absorbansi kontrol negatif. Untuk menghentikan reaksi, di tambahkan 3M NaOH sebanyak 50 µlper sumur.

Identifikasi Cmm berdasarkan uji PCR

Ekstraksi DNA. Koloni bakteri yang diduga Cmm ditumbuhkan pada medium YDC dan diinkubasikan pada suhu 27^oC selama 48-72 jam. Koloni yang tumbuh disuspensikan dalam akuades steril, 5 µl suspensi dicampur dengan 50 µl NaOH (0,05 M) dan direbus selama 15 menit (Anwar 2004).

Amplifikasi. DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan teknik PCR sebagai berikut: hasil lisis (3 µl) ditambahkan ke dalam 22 µl campuran master mix

(Fermentas^TM), ddH2O, dan primer, dengan kondisi PCR sebagai berikut: pra denaturasi 94^oC, 5 menit; denaturasi 94^oC, 1 menit; penempelan (annealing)

13 62^oC, 1 menit, sintesis 72^oC, 30 detik, dan pascaPCR 72^oC, 5 menit. Amplifikasi dilakukan sebanyak 40 siklus (Hadas et al. 2005).

Pasangan primer yang digunakan adalah CM3-5’ CCT CGT GAG TGC CGG GAA CGT ATC C 3’ DAN CM4-5’ CCA CGG TGG TTG ATG CTC GCG AGA T 3’. Amplifikasi DNA spesifik Cmm dengan pasangan primer CM3 dan CM4 menghasilkan potongan DNA dengan ukuran 645 bp (Hadas et al. 2005, Santos et al. 1977 dalam Anwar 2004).

Visualisasi DNA. Hasil amplifikasi dianalisis melalui elektroforesis gel agarose 1,5% mengandung ethidium bromida (0,5 µg/ml) dalam bufer TAE 1x, voltase 70 V selama 60 menit, kemudian diamati dengan UV transiluminator. Hasil positif dengan pasangan primer CM3 dan CM4 berupa pita DNA berukuran 645 bp.

Perbandingan Metode Ekstraksi DNA dan Kondisi PCR

Perbandingan metode ekstraksi DNA Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis

Ekstraksi DNA terhadap biakan murni Cmm dibandingkan dalam empat metode di bawah ini. Metode 1: Sebanyak 5 µl suspensi dicampur dengan 50 µl NaOH (0,05M) dan dilisis dengan pemanasan dalam air mendidih selama 15 menit (Anwar 2004). Metode 2: Sebanyak 5 µl suspensi dimasukkan ke tabung mikro dan disentrifugasi pada 16000 g selama 10 menit. Pelet disuspensikan dalam 25 µl NaOH (0,25N) dan direbus selama 2 menit. Suspensi ditambah 25 µl HCl (0,25N), dan 12,5 µl Tris-HCl (pH 8) yang mengandung 0,1% (v/v) Tween 20, dan disentrifugasi 6000 g selama 2 menit. Pelet disuspensikan dalam 62,5 µl TE buffer (pH 7,5). Metode 3: Sebanyak 5 µl suspensi dimasukkan ke tabung mikro dan disentrifugasi 16000 g selama 10 menit. Pelet disuspensikan dalam 25 µl NaOH (0,25N) dan 25 µl HCl (0,25 N), kemudian dipresipitasi dengan 0,6x volume isopropanol pada suhu -20^oC selama 20 menit. Selanjutnya disentrifugasi pada 16000 g selama 20 menit. Pelet disuspensikan dalam 62,5 µl TE buffer (pH 7,5). Metode 4: Sebanyak 5 µl suspensi dimasukkan ke tabung mikro dan disentrifugasi pada 16000 g selama 10 menit. Pelet disuspensikan dalam 100 µl TEN buffer (pH 8 mengandung 4 mg lysozyme), dan dibiarkan selama 1 jam, kemudian ditambahkan 100 µl Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) 20% dan divortex, diinkubasikan pada suhu 65^oC selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 100 µl Na-acetate (3M) dan dimasukkan dalam es selama 10 menit, kemudian disentrifugasi pada 12000

14 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru, ditambahkan Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25: 24: 1) dengan volume yang sama dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, supernatan dipindahkan ke tabung mikro steril dan ditambahkan 1x volume isopropanol, disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Pelet ditambah 150 µl ethanol 70% dan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringkan, kemudian disuspensikan dalam 62,5 µl TE buffer (pH 7,5) (Lee et al. 2000).

Perbandingan kondisi PCR

Perbandingan kondisi PCR menggunakan isolat Cmm dengan dua kondisi PCR, yaitu Kondisi 1: pra denaturasi 94⁰C, 1 menit; denaturasi 94⁰C, 1,5 menit;

annealing 60⁰C, 1 menit; sintesis 72⁰C, 1,5 menit; dan pasca PCR 72⁰C, 10 menit. Amplifikasi dilakukan sebanyak 35 siklus (Santos et al. (1977) dalam

Anwar (2004). Kondisi 2: pra denaturasi 94^oC, 5 menit; denaturasi 94^oC, 1 menit; annealing 62^oC, 1 menit; sintesis 72^oC, 30 detik; dan post PCR 72^oC, 5 menit. Amplifikasi diulang sebanyak 40 siklus (Hadas et al. 2005).

Uji Beberapa Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis pada Benih Tomat dengan Inokulasi Buatan Inokulasi buatan

Inokulasi buatan pada benih tomat dilakukan dengan merendam benih tomat (varietas San Marino) dalam suspensi Cmm. Biakan murni Cmm berumur 48 jam disuspensikan dalam akuades steril dan diukur optical density (OD) dengan spectrophotometer pada 480 nm pada nilai OD sebesar 0,67 (setara dengan 10⁸ cfu/ml) (Hadas et al., 2005). Suspensi bakteri tersebut diencerkan secara berseri untuk konsentrasi 10⁰-10⁷ cfu/ml.

Benih tomat yang akan diinokulasi buatan sebelumnya diambil sebagian untuk diekstrak, dan diplating media SCM untuk mengetahui konsentrasi Cmm

yang ada pada benih tomat tersebut. Setiap gram benih dicampur dengan 1 ml suspensi bakteri dari setiap pengenceran, kemudian diaduk sampai merata dengan spatula steril dan dibiarkan selama 1 jam pada suhu ruang. Selanjutnya dikeringanginkan selama ± 24 jam pada suhu ruang hingga mendekati kondisi sebelum direndam suspensi bakteri. Benih disimpan selama 3 minggu pada suhu ruang sebelum digunakan dalam penelitian.

15

Ekstraksi Cmm pada benih tomat

Benih yang diinokulasi buatan dibagi menjadi 8 bagian masing-masing 2 gram, kemudian dihancurkan dengan grinder, ditambah 20 ml SCM broth dan atau bufer PBS. Masing-masing ekstrak dishaker pada suhu ruang selama 3 jam, 6 jam, 12 jam, dan 24 jam, dan disentrifugasi pada 1000 rpm selama 10 menit, kemudian supernatan dipindah ke dalam tabung steril. Untuk uji ELISA, ekstrak diambil sebanyak 1 ml dan disentrifugasi pada 6000 g selama 10 menit, kemudian pelet disuspensikan dalam akuades steril sebanyak 2x, dan disentrifugasi kembali pada 6000 g selama 10 menit, selanjutnya pelet disuspensikan dalam 1 ml GEB. Sedangkan untuk PCR, ekstrak diambil sebanyak 200 µl dan disentrifugasi pada 16000 g selama 10 menit. Pelet disuspensikan dalam akuades steril sebanyak 2x, dan sentrifugasi pada 6000 g selama 10 menit, kemudian pelet digunakan untuk ekstraksi DNA.

Deteksi Cmm dengan metode ELISA

Koloni yang diduga Cmm di deteksi dengan metode serologi DAS-ELISA menurut protokol Agdia™, berturut-turut adalah sebagai berikut: antibodi dicampur coating buffer dengan perbandingan 1:200, kemudian plat ELISA diisi sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 4 jam pada suhu ruang atau semalam pada refrigerator (4 ^oC). Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), kemudian diisi dengan suspensi bakteri (isolat disuspensikan dalam GEB, bufer, kontrol negatif, dan kontrol positif, masing-masing sebanyak 100 µl per sumur sesuai lay out pengujian. Plat ELISA diinkubasikan selama 2 jam pada suhu ruang atau semalam pada refrigerator (4 ^oC). Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), enzim konjugat dicampur dalam ECM buffer dengan perbandingan 1:200, kemudian dimasukkan sebanyak 100 µlper sumur dan inkubasikan selama 2 jam pada temperatur ruang. Plat ELISA dikosongkan, dan dicuci dengan PBST 1x (diulang 4-8 kali), Substrat PNP dilarutkan dalam PNP buffer dengan perbandingan 1 mg: 1 ml, kemudian diisikan dalam plat sebanyak 100 µl per sumur dan inkubasikan selama 15 sampai 60 menit pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan terhadap perubahan warna pada sumur. Apabila warna berubah menjadi kuning menunjukkan bakteri yang diuji positif dan apabila tetap bening menunjukkan bakteri yang diuji negatif. Pengamatan dapat dilakukan dengan membaca absorbansi pada microplate reader pada panjang gelombang 405 nm. Hasil dinyatakan positif apabila nilai absorbansi sampel ≥ 2x nilai

16 absorbansi kontrol negatif. Untuk menghentikan reaksi, di tambahkan 3M NaOH sebanyak 50 µlper sumur.

Deteksi Cmm dengan metode PCR

Ekstraksi DNA yang digunakan untuk deteksi Cmm pada benih yang diinokulasi buatan adalah teknik dengan hasil terbaik dari perbandingan empat metode ekstraksi DNA yang dilakukan sebelumnya. DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan teknik PCR sebagai berikut: Sebanyak 5 µl hasil ekstraksi DNA ditambahkan ke dalam 20 µl campuran master mix (Fermentas^TM), ddH2O, dan pasangan primer CM3 dan CM4, dengan kondisi PCR terbaik dari perbandingan 2 metode yang telah dilakukan sebelumnya.

Deteksi Cmm pada Beberapa Varietas Benih Tomat yang Beredar di Pasaran

Deteksi Cmm pada beberapa varietas benih tomat yang diperoleh dari pasaran dilakukan dengan menggunakan metode deteksi dan ekstraksi terbaik pada percobaan yang telah dilakukan sebelumnya. Jumlah yang digunakan dalam penelitian ini masing-masing varietas adalah 2000 benih. Deteksi Cmm

pada beberapa varietas benih tomat dilakukan dengan metode ELISA dan PCR. Benih tomat yang diuji diperoleh dari pasaran.

Tabel 1 Jenis sampel benih tomat yang diuji

No Nama varietas Produsen/Asal Benih

1 Marta PT. East West Seed Indonesia

2 Arthaloka PT. East West Seed Indonesia

3 Ratna PT. East West Seed Indonesia

4 Cosmonot PT. Tanindo Subur Prima

5 Idola PT. Tanindo Subur Prima

6 Sakura PT. Tanindo Subur Prima

7 Viccario PT. Sang Hyang Seri