Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan mulai bulan September sampai dengan Oktober 2009. Sampel susu sapi berasal dari 5 kabupaten di Provinsi Jawa Barat (Tabel 7). Pengujian jumlah total mikroorganisme, E. coli dan S. aureus dilakukan di Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesmavet, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (FKH IPB).
Tabel 7 Lokasi dan jumlah sampel susu sapi yang diambil di Provinsi Jawa Barat
No Lokasi Jumlah sampel susu sapi
1. Kabupaten Bogor 5 2. Kabupaten Bandung 5 3. Kabupaten Cianjur 5 4. Kabupaten Sumedang 5 5. Kabupaten Tasikmalaya 5 Total 25
Pengambilan dan Jumlah Sampel
Jumlah sampel ditentukan secara acak, yaitu masing-masing lima sampel kandang dari setiap kabupaten. Jumlah keseluruhan sampel yang diperiksa sebanyak 25 sampel (Tabel 7). Volume sampel susu minimal 500 ml. Setiap sampel dimasukkan ke dalam kantong plastik steril, kemudian kantong plastik diberi label dan disimpan dalam cool box berisi es. Sampel diuji maksimum 24 jam setelah pengambilan.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian diantaranya buffered peptone water
(BPW) 0.1% (Pronadisa 1402.00), lauryl sulfate tryptose broth (LST broth) (Oxoid CM 0967B), E. colibroth (EC broth) (Oxoid CM 0853B), Levine’s eosin-
methylene blue agar (LEMB agar) (Oxoid CM 0069B), methyl red voges proskauer (MRVP broth) (Oxoid CM 0043B), Koser’s citrate medium, tryptone broth (Oxoid CM 0087B), plate count agar (PCA) (Acumedia Standard Methods Agar 7157A), baird parker agar (BPA) (Oxoid CM 0961B), egg yolk tellurite dan
nutrient agar (NA) (Oxoid CM 0003B).
Reagen yang digunakan di antaranya Kovac’s indole reagent, α-naphthol, 40% KOH, methyl red, pewarnaan Gram. Alat yang digunakan adalah pipet steril, tabung reaksi, tube shaker, tabung Durham, rak tabung reaksi, pembakar bunsen, cawan Petri, batang ose, penangas air, inkubator, dan autoklaf.
Pengujian Jumlah Mikroorganisme (Lukman 2009)
Pengujian jumlah total mikroorganisme (total plate count) dilakukan dengan metode hitungan cawan (plate count method) dengan cara tuang (pour plate method). Sejumlah 1 ml sampel dimasukkan ke dalam 9 ml larutan buffered peptone water (BPW) 0.1% (pengenceran 10-1), selanjutnya dilakukan pengenceran hingga 10-5. Pengenceran 10-3, 10-4, 10-5 masing-masing dipupuk sebanyak 1 ml pada cawan Petri. Media plate count agar (PCA) yang memiliki suhu 44-46 °C dituangkan sebanyak 12-15 ml untuk setiap cawan Petri lalu dihomogenkan dengan cara menggoyang cawan Petri membentuk angka delapan pada permukaan yang rata secara hati-hati kemudian dibiarkan sampai memadat. Cawan Petri kemudian dimasukkan ke dalam inkubator dan diletakkan dengan posisi terbalik (untuk mencegah koloni yang menyebar) serta diinkubasikan pada suhu 35 °C selama 24 jam. Prosedur pengujian TPC diperlihatkan pada Gambar 3. Koloni yang tumbuh pada setiap cawan Petri kemudian dihitung. Rumus perhitungan jumlah mikroba:
Jumlah mikroba (cfu/ml) = Jumlah koloni x Faktor pengenceran*
*
Faktor pengenceran = 1 Tingkat pengenceran
Gambar 3 Prosedur pengujian sampel susu sapi dengan metode hitungan cawan.
Pengujian Jumlah Escherichia coli (Lukman & Latif 2009)
Jumlah E. coli diuji menggunakan metode MPN dengan tiga tabung. Pengenceran desimal dilakukan terhadap sampel susu sapi, kemudian dari larutan sampel tersebut setiap tingkat pengenceran (10-2, 10-3, dan 10-4) dimasukkan masing-masing 1 ml contoh ke dalam tiga tabung berisi 10 ml lauryl sulfate tryptose broth steril dilengkapi tabung Durham (untuk MPN 3 tabung). Tabung diinkubasikan pada suhu 35 °C selama 48 jam. Hasil positif ditandai dengan kekeruhan media (pertumbuhan bakteri) dan pembentukan gas (terlihat pada tabung Durham). Tabung yang memberikan hasil positif diamati dan dihitung
Pengenceran 10-4 (1ml) +
BPW 0.1% (9ml)
Pengenceran 10-5
Pupukan ke dalam Cawan Petri (1ml)
+ PCA (12-15ml) Pupukan ke dalam Cawan Petri
(1ml) + PCA (12-15ml) Pengenceran 10-3 (1ml) + BPW 0.1% (9ml) Pengenceran 10-4
Pupukan ke dalam Cawan Petri (1ml) + PCA (12-15ml) Pengenceran 10-2 (1ml) + BPW 0.1% (9ml) Pengenceran 10-3 Pengenceran 10-1 (1ml) + BPW 0.1% (9ml) Pengenceran 10-2 Sampel susu sapi (1ml)
+ BPW 0.1% (9ml)
nilai MPN presumtif koliform selanjutnya diperoleh nilai MPN presumtif koliform per ml sampel.
Setiap tabung positif dihomogenkan secara perlahan dan hati-hati, lalu dipindahkan satu ose penuh (diameter 3.0 mm) suspensi dari setiap tabung positif masing-masing ke dalam tabung berisi 10 ml E. coli broth steril (EC broth) (dilengkapi tabung Durham), selanjutnya diinkubasikan pada suhu 45.5 ± 0.2 °C selama 48 jam. Tabung EC broth yang positif diambil satu ose penuh suspensi dan masing-masing digoreskan pada agar Levine’s eosine methylen blue (L-EMB agar) untuk kemudian cawan Petri tersebut diinkubasikan pada suhu 35 °C selama 48 jam. Semua cawan Petri diperiksa dengan kriteria mengandung koloni spesifik, yaitu bulat, berwarna gelap di bagian tengahnya, dengan atau tanpa kilauan hijau kemudian dari koloni di atas, diambil dua koloni dari setiap cawan Petri, dengan cara ujung ose disentuhkan ke bagian tengah koloni, kemudian digoreskan pada agar miring nutrient agar (NA). Agar miring tersebut diinkubasikan pada suhu 35 °C selama 24 jam. Pengujian dilanjutkan ke uji biokimia di bawah ini:
(1) uji Indol: koloni dari agar miring NA diinokulasikan pada tryptone broth
dan kemudian diiinkubasikan pada suhu 35 °C selama 24 jam. Uji indol dilakukan dengan menambahkan 0.2 ml Kovac’s indole reagent ke dalam
tryptone broth yang telah diinkubasi. Reaksi positif ditandai oleh terbentuk warna merah di bagian atas larutan.
(2) Voges-Proskauer: koloni dari agar miring NA diinokulasikan pada pupukan MR-VP broth dan diinkubasikan pada suhu 35 oC selama 48 jam. Uji VP dilakukan dengan cara 1 ml suspensi dari MR-VP broth yang telah diinkubasi 48 jam diambil secara aseptis, kemudian dimasukkan ke dalam
tabung reaksi steril dan dilakukan penambahan 0.6 ml α-naphthol dan 0.2 ml KOH 40% selanjutnya dihomogenkan dan dibiarkan selama 4 jam. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna merah muda eosin (eosin pink). (3) Methyl red: tabung MR-VP diinkubasikan kembali pada suhu 35 °C selama
48 jam. Setelah diinkubasi, kemudian ditambahkan 0.3 ml methyl red ke dalam tabung MR-VP. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna merah.
(4) Penggunaan sitrat: dari agar miring NA diinokulasikan koloni (sedikit saja) ke dalam koser’s citrate broth kemudian diinkubasikan pada suhu 35 °C selama 96 jam. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya kekeruhan. (5) Pembentukan gas: dari agar miring NA diinokulasikan koloni pada tabung
berisi lauryl sulfate tryptose broth (dilengkapi tabung Durham) kemudian diinkubasikan pada suhu 35 °C selama 48 jam dan selanjutnya diamati terbentuknya gas dalam tabung durham.
(6) Sifat gram: dilakukan pewarnaan gram dari koloni yang tumbuh pada agar miring NA yang telah diinkubasi selama 18-24 jam. Koliform berbentuk batang pendek (kokoid) berwarna merah (Gram negatif).
Hasil yang menunjukkan bentuk batang pendek atau kokoid, Gram negatif, dan mempunyai pola (+, +, -, -) atau (-, +, -, -) pada uji IMViC dinyatakan sebagai E. coli (Tabel 8). MPN E. coli per ml sampel kemudian dihitung. Prosedur pengujian MPN E. coli diperlihatkan pada Gambar 4.
Gambar 4 Prosedur pengujian jumlah E. coli dengan metode MPN 3 tabung.
Pengenceran 10-1 (1ml)
+ BPW 0.1% (9ml) Sampel susu sapi (1ml)
+ BPW 0.1% (9ml) Pengenceran 10-1 Pengenceran 10-3 (1ml) + BPW 0.1% (9ml) Pengenceran 10-4 Pengenceran 10-2 (1ml) + BPW 0.1% (9ml) Pengenceran 10-3 Tabung MPN (1ml) Tabung MPN (1ml) Tabung MPN (1ml) Pengenceran 10-2 Inokulasi ke L-EMB Inokulasi ke NA Pengujian IMViC (+) (+) (+) Tabung MPN (1ml) Tabung MPN (1ml) Tabung MPN (1ml) Tabung MPN (1ml) Tabung MPN(1ml) Tabung MPN (1ml) Inokulasi ke EC broth
Tabel 8 Hasil uji IMViC untuk identifikasi Escherichia coli
Pengujian Jumlah Staphylococcus aureus (Lukman 2009)
Pengujian jumlah S. aureus dilakukan menggunakan metode hitungan cawan (plate count method) dengan cara tuang (pour plate method). Sejumlah 1 ml sampel dimasukkan ke dalam 9 ml larutan BPW 0.1% (pengenceran 10-1), selanjutnya dilakukan pengenceran hingga 10-4. Pengenceran 10-2, 10-3, 10-4 dipupuk sebanyak 1 ml pada cawan Petri. Media BPA yang memiliki suhu 44 - 46 °C dan telah ditambahkan egg yolk tellurite, dituangkan sebanyak 12-15 ml untuk setiap cawan Petri lalu dihomogenkan dengan cara menggoyang cawan Petri membentuk angka delapan pada permukaan yang rata secara hati-hati kemudian dibiarkan sampai memadat. Cawan Petri dibalik dan diinkubasikan pada suhu 35-37 °C selama 45-48 jam.
Cawan Petri dipilih yang mengandung koloni 20-200 atau cawan Petri yang mengandung koloni khas S. aureus lebih dari 200. Koloni khas S. aureus terlihat bulat, licin, halus, konveks, basah, berdiameter 2-3 cm jika koloni tidak padat, berwarna abu-abu sampai hitam pekat, dikelilingi oleh zona opak (opaque zone), dengan atau tanpa zona luar yang jelas/terang (clear zone). Masing-masing jenis koloni S. aureus (jumlah presumtif S. aureus) kemudian dihitung dan dicatat. Satu atau lebih koloni yang tumbuh diambil dan dilakukan pewarnaan Gram.
Prosedur pengujian S. aureus diperlihatkan pada Gambar 5.
Indol MR VP Sitrat Jenis + + - - Escherichia coli tipe I
- + - - Escherichia coli tipe II - + - ± Escherichia freundii tipe I + + - + Escherichia freundii tipe II
- - + ± Enterobacter aerogenes tipe I - - + + Enterobacter aerogenes tipe II
Gambar 5 Prosedur pengujian jumlah S. aureus dengan metode hitungan cawan.
Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil pengujian laboratorium dianalisis secara deskriptif, meliputi jumlah total mikroorganisme (TPC), E. coli dan S. aureus
kaitannya dengan kualitas susu sapi.
Pupukan ke dalam Cawan Petri (1ml) + BPA (12-15ml) Pengenceran 10-3 (1ml) + BPW 0.1% (9ml) Pengenceran 10-4
Pupukan ke dalam Cawan Petri (1ml) + BPA (12-15ml) Pengenceran 10-2 (1ml) + BPW 0.1% (9ml) Pengenceran 10-3
Pupukan ke dalam Cawan Petri (1ml) + BPA (12-15ml) Pengenceran 10-1 (1ml) + BPW 0.1% (9ml) Pengenceran 10-2 Sampel susu sapi (1ml)
+ BPW 0.1% (9ml)