Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan dari Bulan Juli 2008 sampai Desember 2009, di Rumah Kasa dan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Pengumpulan Sampel Tanaman Anggrek yang Terinfeksi
Survei dilakukan untuk mengumpulkan tanaman yang bergejala khas infeksi virus. Survei dan pengambilan contoh tanaman (sampel) anggrek dilakukan di kebun petani/pengusaha anggrek di Jawa Barat (Gunung Sindur- Bogor, Kebun Raya-Bogor, Balai Penelitian Tanaman Hias Segunung Cipanas- Cianjur, Lembang-Bandung), Jawa Tengah (Magelang), Jawa Timur (Surabaya, Malang) dan DKI Jakarta (Taman Anggrek Indonesia Permai,TAIP). Survei dilakukan untuk mengamati gejala pada tanaman anggrek, mengetahui pengaruh infeksi terhadap anggrek, variasi gejala yang muncul pada jenis tanaman anggrek berbeda serta kejadian penyakit pada beberapa lokasi.
Deteksi dan Identifikasi Virus pada Anggrek Serologi
ORSV dan CymMV dideteksi secara serologi dari sampel tanaman hasil survei dan hasil uji penularan pada tanaman indikator. Teknik direct double antibody sandwich-enzyme linked immunoabsorbent assay (DAS-ELISA) digunakan sesuai prosedur yang dikemukakan oleh pembuat antiserum. Antiserum yang digunakan adalah antiserum spesifik CymMV dan ORSV (DSMZ, Jerman). Analisis secara kuantitatif hasil ELISA ditentukan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm. Pengujian dinyatakan positif jika nilai absorban 1,5x nilai kontrol negatif (tanaman sehat).
Deteksi dengan RT-PCR
Ekstraksi total RNA. Ekstraksi RNA total dilakukan pada sampel tanaman yang dipilih. RNA total diperoleh dari 0,1 g daun bergejala yang digerus dengan nitrogen cair dan diekstraksi menggunakan kit isolasi RNA total (RNAeasy Plant Mini Kit) sesuai prosedur pembuatnya (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA). Total RNA dielusi dengan air bebas RNAse (ddH2O) sebanyak 50 μl.
Sintesis cDNA. RNA total yang diperoleh digunakan sebagai template untuk sintesis first strand complementary DNA (cDNA) pada mesin PCR. Komposisi reagen reaksi RT (reverse transcription) dengan total volume 10 μl (Tabel 3.1). Total RNA yang diperoleh ditambahkan reagen RT sampai mencapai volume total 10 μl kemudian diamplifikasi menggunakan mesin PCR Automated Thermal Cycler (GeneAmp 2400; Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) yang diprogram untuk satu siklus pada 25 oC selama 5 menit, 42 oC selama 60 menit, dan 70 oC selama 15 menit. Hasil RT tersebut kemudian disimpan pada suhu -20 oC sampai siap digunakan untuk reaksi RT-PCR.
RT-PCR. Reagen PCR terdiri dari cDNA, PCR mix (Go taq green, Promega), sepasang primer dan ddH2O (Tabel 3.2). Reaksi PCR diamplifikasi
dengan menggunakan sepasang primer yang mengamplifikasi gen CP untuk masing-masing virus (Tabel 3.3). Amplifikasi dilakukan menggunakan mesin PCR Automated Thermal Cycler dengan kondisi PCR berbeda untuk masing- masing virus (Tabel 3.4).
Tabel 3.1 Komposisi reagen untuk reaksi reverse trancription (RT)
No. Reagent Vol (µl) Konsentrasi
1. Sampel RNA ORSV 2,00
2. Bufer RT 10x 1,00 1x
3. M-MuLV (200U/ μl) 0,50 100 unit
4. 10 mM dNTP 1,00 2,00 mM
5. 10 μM oligo-dT 1,00 1,00 μM
6. Rnase I (40U/ul) 0,50 2,00 unit
7. dd H2O 4,00
Total 10,00
Tabel 3.2 Komposisi reagen untuk reaksi PCR
No Reagen Volume (µl) Konsentrasi akhir
1 Go taq green (Promega) 12,5 1 x
2 cDNA 2,0 < 250 ng
3 Primer forward 10 µM 1,0 1,0 µM
4 Primer reverse 10 µM 1,0 1,0 µM
5 ddH2O 8,5 N.A
Tabel 3.3 Sekuen primer yang digunakan untuk deteksi virus pada anggrek
No Primer Nama Sekuen primer
Produk PCR
(bp)
Referensi
1 CMV-IF 5´-ACCGCGGGTCTTATTATGGT–3’ 382 Aramburu et al.
(2007) CMV-IR 5´-ACGGATTCAAACTGGGAGCA-3’ 2 Potyvirus (MJ1)(f) 5’-TGGTHTGGTGYATHGARAAYGG-3’ 327 Marie-Jeanne et al. (2000) Potyvirus (MJ2)(r) 5’-TGCTGCKGCYTTCATYTG-3’ 3 Tospovirus (gL3637)
5’-CCTTAACAGTDGAAACAT-3’ 800 Chu et al.
(2001) Tospovirus (gL4435c) 5’-CATDGCRCAAGARTGRTARACAGA-3’ 4 CymMV- CPF
5´-CGGGATCCATGGGAGAGTCCACTCCA-3’ 672 Sherpa et al.
(2007) CymMV- CPR 5´-GGAATTCTCAGTAGGGGGTCCAGGC-3’ 5 ORSV- CP-f
5’-GCTCTAGAATGTCTTACACTATTACAGACC-3’ 477 Ajjikuttira et al.
(2005) ORSV-
CP-r
5’- TCCCCCGGGTTAGGAAGAGGTCCAAGTAAG- 3’
Tabel 3.4 Kondisi PCR untuk deteksi virus pada anggrek
No Primer Kondisi PCR
1 CMV-IF & CMV-IR 93,5 oC 3 menit; 93,5 oC, 45 detik; 55 oC, 45 detik; 72 oC, 1 menit ekstensi 72 oC, 5 menit. (35 siklus)
2 MJ1 (f) & MJ2 (r) 94 oC 3 menit; 94 oC, 30 detik; 50 oC, 1 menit; 72 oC, 1 menit ekstensi 72 oC, 10 menit. (45 siklus)
3 gL3637 & gL4435c 93 oC 5 menit; 93 oC, 1 menit; 50 oC, 1 menit; 72 oC, 2 menit ekstensi 72 oC, 5 menit. (35 siklus)
4 CymMV-CPF & CymMV-CPR
95 oC 5 menit; 95 oC, 30 detik; 50 oC, 45 detik; 72 oC, 1 menit ekstensi 72 oC, 10 menit. (35 siklus)
5 ORSV-CP-f & ORSV-CP-r
95 oC 5 menit; 95 oC, 30 detik; 50 oC, 45 detik; 72 oC, 1 menit ekstensi 72 oC, 10 menit. (35 siklus)
Visualisasi DNA. DNA virus hasil amplifikasi dielektroforesis menggunakan gel agarose 1,2% (w/v) (dalam TBE 0,5 X) yang mengandung Ethidium bromide (0,5 mg/10 ml). Penanda DNA yang digunakan adalah ladder 100 bp dan 1 Kb (Fermentas), sebanyak 8 µl yang dicampurkan dengan 2 µl 5x loading buffer. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 70 V DC selama 60 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi dibawah transilluminator ultraviolet dan didokumentasi dengan kamera digital.
Analisis Sekuen Nukleotida dan Asam Amino Gen CP ORSV dan CymMV Perunutan DNA. Sampel DNA hasil RT-PCR digunakan untuk sekuen nukleotida. Sekuen nukleotida ORSV sampel Gunung Sindur-Bogor dilakukan di Laboratorium Charoen-Phokphan Indonesia, Jakarta, sedangkan untuk sampel Kebun Raya-Bogor, Cipanas-Cianjur dan TAIP-Jakarta dilakukan di Laboratorium Genetica Science di Singapura. Sekuen nukleotida untuk semua sampel CymMV dilakukan di laboratorium Macrogen Inc Seoul, Korea Selatan.
Analisis Filogenetika. Sekuen gen CP dianalisis untuk mengetahui tingkat homologi dengan gen CP dari virus yang sama yang telah di deposit pada GeneBank menggunakan software Wu-Blastn (www.ebi.ac.uk). Alignment selanjutnya dilakukan dengan membandingkan homologi isolat ORSV Gunung Sindur-Bogor, Kabun Raya Bogor, Cipanas-Cianjur dan dengan sekuen gen CP 11 isolat ORSV dari beberapa negara dan satu isolat TMV sebagai pembanding diluar grup (outgroup) (Tabel 3.5). Alignment seluruh isolat CymMV Pulau Jawa dilakukan dengan membandingkan homologinya terhadap 10 isolat CymMV dari beberapa negara dan satu isolat Potato Virus X (PVX) sebagai pembanding outgroup (Tabel 3.6). Matriks identitas nukleotida dan asam amino diperoleh menggunakan software BioEdit (Hall 1999).
Pohon filogenetika dikonstruksi menggunakan software MEGA versi 4.0 (Tamura et al. 2007), dengan metode neighbour-joining menggunakan bootstrap 1000 kali pengulangan. Gambar alignment dihasilkan dengan menggunakan program GeneDoc versi 2.7.000 (Nicholas & Nicholas 1997).
Tabel 3.5 Isolat ORSV dari beberapa negara dan TMV pada GeneBank yang dibandingkan dengan enam isolat ORSV asal Indonesia
No. Isolat Kode aksesi Aksesor*
1. Brazil AF515606 Rivas et al. 2000 2. Hangzhou (China) AM398154 Shi & Xu 2006 3. Yunan (China) AM055643 Li et al. 2005 4. Taiwan AF406775 Ajjikuttira et al. 2005 5. India AJ564563 Sherpa et al. 2005 6. Korea Selatan EU683879 Chung 2008.
7. Jerman AJ429093 Letschert et al. 2005 8. Florida (USA) U89894 Hilf & Dawson, 1993 9. Singapura AF455273 Ajjikuttira et al. 2004 10. Jepang X55295 Isomura et al. 1991 11. Thailand AY376394 Srifah 2003
12. TMV Yunan AF516913 Ding et al. 2002
* Aksesor merupakan peneliti yang mendaftarkan sekuen Isolat ORSV hasil penelitiannya
Tabel 3.6 Isolat CymMV dari beberapa negara dan PVX pada GeneBank yang dibandingkan dengan enam isolat CymMV asal Indonesia
No. Isolat Kode aksesi Aksesor*
1. China Phalaenopsis FJ356061 Pan et al. 2008 2. China Cymbidium DQ067883 Zhang & Chen 2005 3. Hawaii EF125180 Vaughan et al. 2008 4. India 1 Cymbidium EU499362 Pooja et al; 2010 5. India 2 Cattleya sp. AJ698947 Sherpa 2006b 6. Jepang AB197937 Tanno & Itoh 2005 7. Korea Selatan AB541562 Choi et al. 2010 8. Perancis AM236028 Moles et al. 2007 9. Singapura AF405719 Ajjikuttira et al. 2005 10. Taiwan AY571289 Wang & Lin 2004 11. PVX PVU19790 Wang et al. 1991/1995
* Aksesor merupakan peneliti yang mendaftarkan sekuen Isolat ORSV hasil penelitiannya
ke GeneBank.
Respon Pada Tanaman Indikator
Perbanyakan sumber inokulum. Untuk mendapatkan virus murni dari tanaman anggrek yang bergejala dilakukan isolasi pada tanaman indikator Datura stramonium. Tanaman bergejala diperoleh dari tanaman anggrek asal Gunung Sindur-Bogor. Tanaman anggrek yang positif terinfeksi ORSV berdasarkan hasil ELISA digerus dalam larutan bufer fosfat 0,05 M pH 7,0 (29.1 ml 0.1 M NaOH, 50 ml 0.1 M KH2PO4) dengan perbandingan 1 : 5 (0.1 gram per
500 μl larutan bufer fosfat (1:5 b/v) menggunakan mortar dan pistil steril. Daun tanaman D. stramonium yang akan diinokulasi dilukai dengan karborundum 600 mesh dengan menaburkannya pada permukaan daun, kemudian cairan perasan (sap) dari tanaman sakit dioleskan pada permukaan daun dengan cotton bud, dilakukan searah tulang daun. Setiap tanaman diinokulasi pada 2 helai daun termuda yang telah membuka penuh. Setelah pengolesan inokulum, permukaan daun dibilas dengan aquades untuk membuang sisa karborundum yang masih melekat pada permukaan daun tanaman uji. Pengamatan gejala dan waktu inkubasi dilakukan sampai 30 hari setelah inokulasi.
D. stramonium akan menunjukkan gejala lesio lokal pada 3–21 hari setelah diinokulasi virus. Satu lesio tersebut kemudian diinokulasikan lagi ke tanaman D. stramonium secara mekanis dan hal ini dilakukan secara berulang sampai tiga kali untuk mendapatkan virus murni. Lesio lokal diakhir inokulasi ke tiga kemudian diinokulasi ke tanaman Nicotiana benthamiana untuk
memperbanyak virus. Tanaman N. benthamiana yang bergejala digunakan sebagai inokulum virus untuk uji penularan ORSV pada tanaman indikator.
Penularan pada tanaman indikator. Tanaman uji yang digunakan sebagai tanaman indikator adalah D. stramonium, N. tabacum cv. Xanthi, N. benthamiana, Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Gomphrena globosa, Cassia occidentalis, dan vanili (Vanilla planifolia). Tanaman indikator ditumbuhkan dari benih yang ditanam dalam pot-pot kecil (diameter sekitar 15 cm) dengan media tanah + pupuk kandang (1:1) dan dipelihara dalam rumah kaca kedap serangga sampai siap diinokulasi.
Daun-daun tanaman indikator diinokulasi dengan sap N. benthamiana yang terinfeksi ORSV. Sap disiapkan dengan menggerus daun N. benthamiana hasil perbanyakan inokulum dalam 500 mM bufer fosfat pH 7,2 (1:5 b/v) dengan mortar. Sap dioleskan dengan cotton bud di atas permukaan daun tanaman indikator yang telah terlebih dahulu ditaburi Carborundum. Tanaman indikator yang telah diinokulasi dipelihara sebaik-baiknya dalam rumah kasa kedap serangga dan waktu inkubasi diamati setiap hari sampai muncul gejala.
