3.1. Lokasi pengambilan sampel.
Pengambilan sampel larva A. aegypti berasal dari Kota Surabaya. Koleksi
larva dilakukan pada beberapa lokasi berdasarkan tingkat endemisitas yang mempunyai kasus demam berdarah tinggi, kasus demam berdarah sedang dan kasus demam berdarah rendah. Dengan menggunakan kategori berikut :
- Lokasi dengan kasus tinggi ≥100 yang diwakili Kecamatan Tambaksari dan
Sawahan
- Lokasi dengan kasus sedang 50- 99 yang diwakili Kecamatan Wonocolo dan Wiyung
- Lokasi dengan kasus rendah ≤ 49 yang diwakili Kecamatan Bulak dan
Pakal.
Pemilihan lokasi berdasarkan data sekunder Dinas Kesehatan Kota (DKK) mengenai jumlah kasus DBD pertahun di wilayah Kota Surabaya (Lampiran 2) dan merupakan lokasi yang mudah dijangkau serta kepadatan permukiman sangat tinggi.
3.2. Waktu dan Tempat penelitian.
Waktu penelitian di laksanakan pada bulan Juli sampai Desember 2009. Tempat penelitian di Kota Surabaya dilanjutkan di Insektarium Parasitologi dan Entomologi Kesehatan (PEK) – IPB Bogor.
3.3. Alat dan Bahan penelitian.
Perlengkapan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ”WHO
Susceptibility test kit, hygrometer dan termometer, penghitung waktu (timer), gelas
plastik, aspirator, pinset, kapas, karet gelang, handuk (basah), ovitrap, kertas saring, spidol, kandang nyamuk (40x40x60cm), nampan (20x30x5cm), pipet plastik, botol dan kertas perekat (Lampiran 6). Bahan yang digunakan adalah kertas berinsektisida
(impregnated paper) malation 5%, larutan gula, marmut, rebusan ati ayam serta
sejumlah nyamuk A. aegypti yang akan diuji, kira-kira 60 ekor setiap percobaan.
3.4. Metode Penelitian.
Pengadaan Nyamuk untuk uji kerentanan. Larva nyamuk dikumpulkan dari tiga lokasi pada TPA yang berada di dalam maupun luar rumah kemudian diidentifikasi. Larva yang didapat ditampung dalam botol aqua (650 ml) diberi label
kemudian dikirim ke laboratorium. Pengiriman larva dengan wadah termos es yang diberi kain basah/handuk guna menjaga kelembaban agar larva tidak mati.
Di laboratorium larva dipelihara di dalam nampan plastik (20x30x5 cm) dan diberi makan rebusan ati ayam. Setelah menjadi pupa maka pupa dipindahkan ke dalam gelas plastik, selanjutnya dimasukkan dalam kandang nyamuk (40x40x60 cm), dipelihara sampai menjadi nyamuk dewasa serta di identifikasi untuk memastikan jenisnya.
Nyamuk setelah menjadi dewasa umur 2 – 3 hari, baru diberi makan darah marmut, sebelumnya marmut dicukur bulunya pada bagian punggung setelah itu dimasukkan ke dalam kandang jepit. Disamping itu di dalam kandang nyamuk disediakan larutan air gula 10% ke dalam botol tersebut dimasukkan kapas agar nyamuk dapat menghisap air gula melalui kapas untuk memberi makan nyamuk jantan. Setelah menghisap darah 2-3 hari, dipasang perangkap telur menggunakan ovitrap yang berisi air dan pada bagian tepinya diberi kertas saring secara melingkar sebagai tempat peletakkan telur. Setiap kertas yang telah ada telurnya diambil dan dikeringkan secukupnya dan dipasang kembali kertas saring yang baru.
Setelah telur generasi pertama (F1) terkumpul kemudian dengan cara yang sama telur-telur ditetaskan menurut lokasinya sampai diperoleh nyamuk dewasa generasi ketiga (F3). Nyamuk F3 inilah yang kemudian digunakan untuk uji kerentanan.
Uji kerentanan. Uji kerentanan mempergunakan standar WHO Susceptibility
test kit. Percobaan ini dilakukan berdasarkan kontak nyamuk dewasa dengan
insektisida malation (impregnated paper) dengan konsentrasi 5%, sebagai
pembanding digunakan nyamuk strain Liverpool yang ada di insektarium PEK. Jumlah nyamuk yang digunakan sebanyak 20 ekor tiap lokasi dengan tiga ulangan.
Sebagai kontrol, digunakan 20 ekor nyamuk A.aegypti yang berasal dari ketiga
lokasi yang dikontakkan dengan kertas tanpa insektisida dalam tabung bertanda hijau.
Dua puluh ekor nyamuk betina yang seragam umur dan kondisi perut kenyang air gula diambil dari kandang, menggunakan aspirator kemudian dimasukkan ke
dalam tabung penyimpanan (holding tube) bertanda hijau. Selanjutnya nyamuk di
dilapisi kertas berinsektisida malation 5% dengan cara meniup pelan-pelan. Nyamuk dibiarkan di dalam tabung kontak selama waktu yang telah ditentukan dengan masa kontak bervariasi yakni 5 menit, 15 menit, 30 menit, 45 menit dan 60 menit. Kematian nyamuk dihitung setelah 24 jam penyimpanan. Selama penyimpanan dijaga suhu dan kelembaban dengan meletakkan handuk basah/kapas basah pada tabung penyimpanan.
Pengamatan. Setelah masa kontak kemudian nyamuk tersebut dipindahkan ke
tabung penyimpanan (holding tube) warna hijau dengan cara ditiup secara perlahan,
selanjutnya di simpan selama 24 jam dan pada bagian atas tabung penyimpanan
(holding tube) diberi kapas yang mengandung larutan air gula 5%. Disimpan pada
kondisi yang baik untuk hidup nyamuk yaitu suhu 27 – 30 ºC dan kelembaban nisbi udara antara 75% sampai 90%. Setelah 24 jam, dari masing-masing tabung diperiksa jumlah kematian nyamuk, dan bila ada dicatat kematiannya.
Penghitungan. Penghitungan hasil percobaan dilakukan setelah 24 jam masa penyimpanan, dihitung jumlah nyamuk yang mati dan yang masih hidup. Nyamuk dinyatakan mati bila sudah tidak mampu bergerak lagi.
Apabila pada kelompok nyamuk pembanding terjadi kematian antara 5 - 20 % maka data harus dilakukan koreksi dengan rumus Abbot yaitu:
% kematian nyamuk uji - % kematian kontrol
--- x 100 % 100 - % kematian kontrol.
Apabila kematian pada nyamuk pembanding lebih besar dari 20% maka harus diuji ulang.
Penentuan Status Kerentanan. Penentunan uji kerentanan dengan masa kontak 60 menit dan pengamatan selama 24 jam dapat dihasilkan tiga golongan populasi nyamuk yaitu 1) resisten, bila kematian nyamuk di bawah 80%; 2) toleran, bila kematian nyamuk antara 80 - 97% dan 3)rentan bila kematian nyamuk antara 98 - 100% (WHO, 1975).
Rancangan Percobaan dan Analisis Data. Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan lima perlakuan dan tiga ulangan, kemudian dibuat persamaan regresi antara waktu kontak dengan mortalitas sehingga dapat diketahui status kerentanan terhadap insektisida. Analisis kerentanan tiap-tiap lokasi
didasarkan pada persentase kematian nyamuk dengan uji statistik regresi dan analisis probit serta uji beda nyata Duncan menggunakan bantuan sofware program
minitab versi 15 dan EFA.
Analisis Hasil Uji Kerentanan Nyamuk. Analisis hasil uji kerentanan nyamuk atau larva dilihat pada gambar garis regresi, bila pada gambar terlihat garis regresi bergeser ke kanan berarti ada perubahan dalam tingkat kerentanan nyamuk (Dep.Kes. R.I. 1986). Untuk membuktikan secara komprehenshif status toleransi
nyamuk A. aegypti terhadap malation dilakukan perhitungan probit untuk
menentukan LT50, LT95 dan rasio resistensi (RR). Setelah LT50, LT95 diperoleh dari
perhitungan probit, maka nilai rasio resistensi (RR) dapat dihitung menggunakan
persamaan berikut ini (Rawlins, 1998., Ponlawat et al, 2005):
LT strain yang diamati RR = --- LT strain pembanding