ARAB TERHADAP pH RENDAH DAN GARAM EMPEDU (Characteristics and Survival of Lactobacillus plantarum Encapsulated with
BAHAN DAN METODE
Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat (BAL) yang digunakan sebanyak sepuluh isolat yang berpotensi probiotik, yaitu L. plantarum mar8, L. plantarum dmnd, L. plantarum s4, L. plantarum sgn4, L. plantarum p8, L. plantarum lac3, L. plantarum d4, L. plantarum pdgn3, L. plantarum pdbn6 yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Puslit Biologi LIPI Bogor dan L. plantarum sa28k dari Laboratorium Mikrobiologi Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian IPB. Semua isolat tersebut telah berpotensi sebagai probiotik
49
berdasarkan sifat-sifat antimikroba serta ketahanan terhadap asam dan garam empedu.
Persiapan dan Pengawetan Probiotik
Pemurnian dan peremajaan dilakukan untuk memperoleh kultur murni dari probiotik, menggunakan metode Harmayani et al. 2001 dengan modifikasi pada media yang digunakan. Semua probiotik dimurnikan lebih dahulu dengan metode goresan kuadran yang diulangi beberapa kali sampai diperoleh koloni terpisah dengan menggunakan media GYP. Probiotik yang telah dimurnikan, disegarkan dan diperbanyak. Kultur stok dalam agar GYP disimpan pada suhu rendah (suhu 4-5 oC).
Produksi Biomasa dan Suspensi Probiotik
Dua probiotik dengan ketahanan panas tertinggi yang telah ditumbuhkan pada agar miring GYP, ditumbuhkan kembali pada media GYP cair selama 24 jam pada suhu 37 oC, yang selanjutnya digunakan sebagai kultur antara. Sebanyak 10 ml kultur antara ditumbuhkan pada GYP cair 1000 ml (1:100) yang digunakan untuk produksi biomasa. Selanjutnya biomasa dipanen dengan cara sentrifugasi (5000xg) selama 10 menit pada 4 oC, dan dicuci dua kali dengan buffer fosfat (Harmayani et al. 2001).
Dua probiotik dengan ketahanan panas tertinggi, ditumbuhkan kembali pada media 10% susu skim cair steril selama 24 jam pada suhu 37 oC, yang selanjutnya digunakan sebagai kultur antara. Sebanyak 2,5 ml kultur antara dimasukkan ke dalam 250 ml larutan sus u skim 10% steril (b/v), kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC (Yulianto 2004).
Enkapsulasi Probiotik dan Spray Drying
Kultur probiotik yang digunakan sebelum dienkapsulasi adalah dalam bentuk biomasa dan suspensi. Biomasa yang diperoleh diresuspensikan ke dalam
akuades steril dan dienkapsulasi dengan susu skim, gum arab serta campuran susu skim dan gum arab. Perbandingan biomasa dan bahan enkapsulasi yang digunakan adalah sebesar 3:7 (b/b) (Lian et al. 2002).
Probiotik dalam bentuk suspens i yang telah ditumbuhkan dalam susu skim 10% (b/v) langsung dikeringkan dengan spray dryer, kemudian selanjutnya suspensi dienkapsulasi dengan gum arab dengan perbandingan 1:1 (b/b) (Yulianto 2004).
Kombinasi perlakuan enkapsulasi adalah sebagai berikut : biomasa - susu skim, biomasa - gum arab, biomasa - susu skim - gum arab, suspensi - susu skim dan suspensi - susu skim - gum arab. Campuran dihomogenisasi, kemudian dikeringkan dengan BUCHI mini spray dryer pada suhu inlet 100 oC dan suhu outlet 50 oC.
Uji Ketahanan Terhadap pH Rendah (pH 2)
Ketahanan probiotik pada pH 2 dinyatakan dalam persen jumlah yang tahan terhadap pH 2 dibandingkan jumlah pada kondidi normal (pH 7). Pengujian ketahanan terhadap pH rendah (pH 2) dilakukan menurut metode Lian et al. (2003), dengan cara mikrokapsul sebanyak 1 g dan 1 ml kultur dalam GYP yang sudah berumur 24 jam dimasukkan dalam 9 ml GYP kontrol dan GYP asam yang diatur pada pH 2 menggunakan HCl, kemudian divortex dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 3 jam. Setelah itu dipanen dengan sentrifugasi pada 5000 x g selama 10 menit pada suhu 4 oC dan dicuci dua kali dengan buffer fosfat. Pellet diberi 10ml akuades dan selanjutnya dibuat seri pengenceran dan di taburkan dalam cawan serta diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Jumlah koloni yang tumbuh dihitung baik yang ada di kontrol maupun yang di perlakuan. Ketahanan terhadap asam dihitung berdasarkan rumus :
Ketahanan (%) = x 100% Log jumlah sel pada media pH 2/ml
51
Uji Ketahanan Terhadap Garam Empedu
Uji terhadap garam empedu dilakukan menurut Lian et al. (2003), dan konsentrasi garam empedu yang digunakan 3% dengan penentuan akhir menggunakan metode hitungan cawan. Mikrokapsul sebanyak 1 g dan 1 ml kultur dalam GYP yang sudah berumur 24 jam, dimasukkan dalam 9 ml GYP (Kontrol) dan GYP yang berisi garam oxgal 3% (b/v) kemudian divortex dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 3 jam. Setelah itu dipanen dengan sentrifugasi pada 5000 x g selama 10 menit pada suhu 4 oC dan dicuci dua kali dengan buffer phospat. Selanjutnya pellet diresusitasi dengan 10 ml akuades dan selanjutnya dibuat seri pengenceran dan di plating serta diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Jumlah koloni yang tumbuh dihitung baik yang ada di kontrol maupun yang di perlakuan. Ketahanan terhadap garam empedu dihitung berdasarkan rumus :
Ketahanan (%) = x 100%
Analisis Total Kapang Khamir
Analisis kontaminasi kapang khamir dilakukan pada media YMA agar. Mikrokapsul sebanyak 1 g secara aseptis dimasukkan ke dalam 9 ml akuades steril dan divortex, selanjutnya diencerkan sampai pengenceran 10-2. Jumlah kontaminan dihitung dengan metode hitungan cawan dengan beberapa seri pengenceran setelah diinkubasi pada 37 oC selama 48 jam. Kemudian dihitung total kapang dan khamir berdasarkan standar plate count (Fardiaz 1992).
Ukuran dan Bentuk Mikrokapsul
Diameter dan bentuk dari mikrokapsul diperiksa dengan Scanning Electron Microscope, dengan cara mikrokapsul ditempatkan merata pada aluminium stubs yang berupa lempengan berdiameter 6 mm kemudian divakum dengan gas argon sampai stabil dan dilapisi emas dengan sputter coater selama 20 detik. Selanjutnya aluminium stubs yang berisi sampel dimasukkan pada alat electron
Log jumlah sel pada media uji/ml Log jumlah sel pada media normal/ml
microscope dan diamati diameter mikrokapsul serta bentuk mikroskopis dari mikrokapsul (Lian et al. 2002).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ketahanan Probiotik pada pH Rendah
Hasil uji ketahanan mikrokapsul probiotik terhadap pH renda h (pH 2) dapat dilihat pada Gambar 7 dan data selengkapnya pada Lampiran 12. Probiotik yang dienkapsulasi mempunyai ketahanan yang jauh lebih tinggi dari pada yang tidak dienkapsulasi. Ketahanan mikrokapsul probiotik sekitar 67% sedangkan sel bebas sekitar 45%, berbeda nyata secara statistik. Lee dan Heo (2000) juga menunjukkan bahwa ketahanan bakteri yang diimobilisasi dengan alginat menghasilkan ketahanan sekitar 40% setelah dipaparkan pada pH 2 selama 120 menit dan tergantung pada konsentrasi gel dan ukuran butiran. Sun dan Griffiths (2000) melaporkan bahwa imobilisasi Bifidobacteria dalam butiran yang mengandung campuran gelan-xanthan gum meningkatkan toleransinya terhadap lingkungan asam tinggi. Menurut Picot dan Lacroix (2004), enkapsulasi dapat mengur angi kerusakan dan melindungi sel dari aktivitas hidrolitik asam lambung.
Bentuk Biomasa dan Suspensi. Mikrokapsul probiotik untuk semua jenis bahan enkapsulasi yang menggunakan biomasa dan suspensi memiliki ketahanan terhadap pH rendah yang tidak berbeda nyata secara statistik. Untuk probiotik yang menggunakan biomasa ketahanannya sekitar 72%, sedangkan untuk yang suspensi ketahanannya sebesar 60%. Kultur biomasa mengalami penurunan jumlah sel setelah perlakuan sebesar 2,5 log cfu/g yang hampir sama dibandingkan kultur suspensi (2,6 log cfu/g).
Jenis Bahan Enkapsulasi. Hasil analisis statistik menunjukkan nilai ketahanan kultur probiotik terhadap pH rendah untuk ketiga kombinasi jenis bahan enkapsulasi tersebut tidak berbeda nyata baik pada kultur biomasa maupun suspensi. Pada kultur biomasa diperoleh hasil ketahanan pada penggunaan gum
53
arab, campuran susu skim-gum arab dan susu skim masing-masing sebesar 75%, 71% dan 69%. Ketahanan kultur probiotik terhadap pH rendah pada penggunaan campuran susu skim-gum arab 62% dan pada penggunaan susu skim 59%.
a) L. plantarum sa28k b) L. plantarum mar8
0 20 40 60 80 Ketahanan (%)
Sa-sel bebasSa-Bio-s Sa-Bio-g Sa-Bio-s-gSa-Sus-s Sa-Sus-s-g 0
20 40 60 80
Ketahanan (%)
Mar-sel bebasMar-Bio-sMar-Bio-gMar-Bio-s-gMar-Sus-sMar-Sus-s-g
Gambar 7 Grafik ketahanan terhadap pH rendah (pH 2,0) mikrokapsul probiotik L. plantarum sa28k (a) dan L. plantarum mar8 (b) pada beberapa kombinasi bahan enkapsulasi
(Sa: L. plantarum sa28k, Mar: L. plantarum mar8, Bio: biomasa, Sus: suspensi, s: skim, g: gum arab)
Jenis Probiotik. Ketahanan probiotik terhadap pH rendah untuk kedua jenis probiotik tidak berbeda nyata secara statistik. Untuk L. plantarum sa28k sekitar 67% dan untuk L. plantarum mar8 sekitar 68%. Penurunan sel L. plantarum sa28k sekitar 2,6 log cfu/g dan L. plantarum mar8 sekitar 2,4 log cfu/g, dengan populasi akhir berkisar antara 104-106 cfu/g berat kering.
Pada kultur pH rendah, jumlah bakteri pada mikrokapsul dari kedua jenis probiotik L. plantarum sa28k dan L. plantarum mar8 mengalami penurunan 2,4 log cfu/g, sedangkan pada sel bebas akan mengalami penurunan lebih besar yaitu 4,3 log cfu/g. Fenomena serupa juga ditemukan oleh Lian et al. (2003), dimana mikrokapsul Bifidobacteria yang dipaparkan pada asam tinggi (pH 2,0) mengalami penurunan sebanyak 3 log cfu/g.
Keberhasilan pengembangan pangan probiotik tidak hanya tergantung pada sifat peningkatan kesehatannya namun juga pada viabilitas probiotik dalam produk selama umur simpannya (shelf life) termasuk ketahanannya terhadap kondisi yang tidak menguntungkan dalam saluran pencernaan (Desmond 2002).
Stres yang pertama terjadi pada sel bakteri yang memasuki saluran pencernaan adalah terpapar pada asam lambung (Chou dan Weimer 1999). Bakteri asam laktat tidak hanya tumbuh lambat pada pH rendah tetapi mungkin juga mengalami kerusakan asam dan menurun viabilitasnya jika sel bakteri berada pada kondisi pH rendah.
Ketahanan Probiotik terhadap Garam Empedu
Hasil penelitian pengaruh garam empedu (3%) terhadap penurunan jumlah koloni mikrokapsul probiotik disajikan pada Gambar 8 dan data selengkapnya pada Lampiran 14. Ketahanan mikrokapsul probiotik terhadap garam empedu jauh lebih tinggi dari pada bakteri yang tidak dienkapsulasi dan hasil analisis statistik menunjukkan nilai ketahanannya berbeda nyata. Ketahanan mikrokapsul probiotik sekitar 79%, sedangkan yang tidak dienkapsulasi 64%. Mosilhey (2003) melaporkan bahwa L. acidophilus bebas dan terenkapsulasi yang dikondisikan pada garam empedu 2% selama 4 jam inkubasi pada 370C, menunjukkan penurunan jumlah sel bebas yang cukup tinggi (6 log cfu/g) , sedangkan sel terenkapsulasi lebih toleran terhadap garam empedu (3 log cfu/g).
Bentuk Biomasa dan Suspensi. Ketahanan probiotik terhadap garam empedu baik untuk kultur biomasa maupun suspensi tidak berbeda nyata secara statistik. Untuk kultur biomasa , ketahanannya sebesar 83%, sedangkan kultur suspensi ketahanannya 75%. Kultur biomasa mengalami penurunan jumlah sel setelah perlakuan yang hampir sama dibandingkan kultur suspensi. Kultur biomasa mengalami penurunan jumlah sel sekitar 1,6 log cfu/g, sedangkan kultur suspensi sebesar 1,7 log cfu/g.
Jenis Bahan Enkapsulasi. Hasil analisis statistik nilai ketahanan kultur probiotik terhadap garam empedu menunjukkan bahwa untuk semua jenis bahan enkapsulasi tidak berbeda nyata. Pada kultur biomasa diperoleh hasil ketahanan pada penggunaan gum arab dan campuran susu skim-gum arab sebesar 84% dan susu skim sebesar 81%. Pada kultur suspensi, analisis statistik nilai ketahanan kultur probiotik terhadap garam empedu untuk kedua kombinasi jenis bahan
55
enkapsulasi tersebut tidak berbeda nyata. Ketahanan terhadap garam empedu pada penggunaan campuran susu skim-gum arab 76%, diikuti dengan penggunaan susu skim 73%.
a) L. plantarum sa28k b) L. plantarum mar8
0 20 40 60 80 100 Ketahanan (%)
Sa-sel bebasSa-Bio-s Sa-Bio-g Sa-Bio-s-gSa-Sus-sSa-Sus-s-g
0 20 40 60 80 100 Ketahanan (%)
Mar-sel bebasMar-Bio-sMar-Bio-gMar-Bio-s-gMar-Sus-sMar-Sus-s-g
Gambar 8 Grafik ketahanan terhadap garam empedu mikrokapsul probiotik L. plantarum sa28k (a) dan L. plantarum mar8 (b) pada beberapa kombinasi bahan enkapsulasi
(Sa: L. plantarum sa28k, Mar: L. plantarum mar8, Bio: biomasa, Sus: suspensi, s: skim, g: gum arab)
Je nis Probiotik. Hasil analisis statistik menunjukkan ketahanan dari kedua jenis probiotik tidak berbeda nyata. Ketahanan probiotik terhadap garam empedu untuk kedua jenis probiotik hampir sama, untuk L. plantarum sa28k sebesar 80% dan L. plantarum mar8 sebesar 79%. Penurunan jumlah sel L. plantarum sa28k sekitar 1,5 log cfu/g dan L. plantarum mar8 sekitar 1,7 log cfu/g, dengan populasi akhir sekitar 105-107 cfu/g berat kering.
Pada perlakuan garam empedu, jumlah bakteri pada mikrokapsul dari kedua jenis probiotik L. plantarum sa28k dan L. plantarum mar8 akan mengalami penurunan 1,6 log cfu/g, sedangkan pada sel bebas akan mengalami penurunan lebih besar yaitu 2,7 log cfu/g. Penurunan yang cepat dan nyata pada mikrokapsul yang dipaparkan pada garam empedu juga telah dilaporkan oleh Lian et al. (2003), dimana ketahanan Bifidobacteria terenkapsulasi lebih tinggi dibanding sel bebas tanpa enkapsulasi. Hal ini menunjukkan bahwa enkapsulasi dengan berbagai bahan enkapsulasi yang diujikan memperpanjang efek protektif sel terhadap larutan garam empedu.
Untuk dapat bertahan dan tumbuh pada saluran pencernaan, bakteri asam laktat sebagai kultur probiotik harus mampu melewati berbagai kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan. Salah satunya adalah pada saat probiotik memasuki bagian atas saluran usus dimana empedu disekresikan ke dalam usus (Mosilhey 2003).
Analisis Total Kapang Khamir
Untuk mengetahui kontaminasi kapang khamir pada mikrokapsul probiotik dapat dilihat pada Gambar 9 dan data selengkapnya pada Lampiran 16. Total kapang khamir untuk semua perlakuan sekitar 1,2-1,9 log cfu/g mikrokapsul. Seveline (2005) melaporkan kontaminasi kapang khamir pada produk mikrokapsul probiotik dengan bahan enkapsulasi dekstrin dan triasil gliserol sekitar 0,5-1,1 log cfu/g berat kering produk. Hal serupa juga dikemukakan oleh Eddy (1999), kontaminasi kapang dan khamir pada produk yogurt kering semprot sekitar 2-3 log cfu/g produk.
a) L. plantarum sa28k b) L. plantarum mar8
0.0 1.0 2.0 3.0 Jumlah (log/g) Sa
-Bio-s Sa-Bio-g Sa-Bio-s-g Sa-Sus-s Sa-Sus-s-g
0.0 1.0 2.0 3.0
Jumlah (log/g)
Mar-Bio-s Mar-Bio-g Mar-Bio-s-gMar-Sus-s Mar-Sus-s-g
Gambar 9 Grafik total kapang khamir mikrokapsul probiotik L. plantarum sa28k (a) dan L. plantarum mar8 (b) pada beberapa kombinasi bahan enkapsulasi
(Sa: L. plantarum sa28k, Mar: L. plantarum mar8, Bio: biomasa, Sus: suspensi, s: skim, g: gum arab)
Pada spesifikasi persyaratan mutu susu bubuk tanpa lemak (susu skim), SNI no 01-2970-1999, tidak terdapat persyaratan kontaminasi khusus kapang khamir,
57
yang ada hanya cemaran angka total mikroba. Standar maksimal jumlah mikroba total yang ditetapkan adalah 5 x 105 cfu/g (BSN 1999).
Ukuran dan Bentuk Mikrokapsul
Gambar 10 menunjukkan mikrograf scanning electron dari mikrokapsul probiotik yang diperoleh setelah pengeringan dengan berbagai kombinasi bahan enkapsulasi. Mikrokapsul tersebut secara umum berbentuk bulat dengan permukaan yang retak-retak, tidak rata atau terdapat lipatan yang dalam pada permukaannya. Ukuran dari mikrokapsul bervariasi, yaitu sekitar 5-12 µm.
Sel bebas Suspensi susu skim Suspensi susu skim-gum arab
Biomasa susu skim Biomasa gum arab Biomasa susu skim-gum arab Gambar 10 Mikrokapsul yang dilihat dengan scanning electron microscope
(perbesaran 3500x - lebar : 37,7 µm)
Seperti pengamatan yang dilakukan Charpentier et al. (1998), mikrokapsul gum arab, gelatin dan pati terlarut berbentuk seperti bola yang telah terdehidrasi. Dilain pihak, permukaan mikrokapsul susu skim terlihat berbutir-butir dan retak. Menurut Lian et al. (2002), retak tersebut mungkin memfasilitasi lepasnya panas dari dalam partikel setelah pengeringan, menyebabkan kerusakan akibat panas
(heat injury) yang lebih sedikit terhadap mikroorganisme yang terperangkap di dalamnya. Hal ini mungkin yang menjelaskan ketahanan probiotik lebih tinggi setelah spray drying dengan susu skim dibanding dengan komposisi bahan enkapsulasi lainnya.
KESIMPULAN
Kultur probiotik yang dienkapsulasi biomasa menghasilkan ketahanan pada pH rendah (pH 2) dan garam empedu (3%) yang tidak berbeda nyata dengan bentuk suspensi.
Bahan enkapsulasi susu skim, gum arab dan kombinasi susu skim gum arab memberikan nilai ketahanan pada pH rendah (pH 2) dan garam empedu (3%) yang tidak berbeda nyata secara statistik.
Penggunaan galur L. plantarum sa28k dan L. plantarum mar8 me mberikan hasil yang tidak berbeda nyata secara statistik untuk semua kombinasi dan jenis bahan enkapsulasi ditinjau dari ketahanannya terhadap pH rendah (pH 2) dan garam empedu (3%).
Kontaminasi kapang khamir pada mikrokapsul probiotik tidak berbeda nyata secara statistik untuk semua perlakuan, yaitu sekitar 1,2-1,9 log cfu/g mikrokapsul.
Hasil pemeriksaan dengan SEM menunjukkan mikrokapsul secara umum berbentuk bulat dengan permukaan yang retak-ratak, tidak rata atau terdapat lipatan yang dalam pada permukaannya. Ukuran dari mikrokapsul bervariasi, yaitu berkisar antara 5-12 µm.
59
.
DAFTAR PUSTAKA
[BSN] Badan Standarisasi Nasional. 1999. Susu Bubuk. SNI 01-2970-1999. Jakarta.
Chandramouli V, Kailasapathy K, Peiris P, Jones M. 2004. An improved method of microencapsulation and its evaluation to protect Lactobacillus spp. in simulated gastric condition. J of Microbiol Methods 56:27– 35.
Charpentier CA, Gadille P, Digat B, Benoit JB. 1998. Microencapsulation of Rhizobacteria by spray drying : formulation and survival studies. J Microencapsulation 15:639–659.
Desmond C, Stanton C, Collins GFK, Ross RP. 2002. Improved survival of Lactobacillus paracasei NFBC 338 in spray dried powders containing gum acacia. J of Appl Microbiol 93:1003-1012.
Eddy FF. 1999. Pembuatan yoghurt instant dengan menggunakan pengering semprot [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. PT Gramedia, Jakarta.
Harmayani E, Ngatirah, Rahayu ES, Utami T. 2001. Ketahanan dan viabilitas probiotik bakteri asam laktat selama proses pembuatan kultur kering dengan metode freeze dan spray drying. J Tek dan Ind Pangan 12:126-132.
Lee KY and Heo TR. 2000. Survival of Bifidobacterium longum immobilized in calcium alginate beads in simulated gastric juices and bile salt solution. J Appl and Env Microbiol 66:869-873.
Lian WC, Hsio HC, Chou CC. 2002. Survival of Bifidobacterium longum after spray drying. Int J Food Microbiol 74:79– 86.
Lian WC, Hsio HC, Chou CC. 2003. Viability of microencapsulated Bifidobacteria in simulated gastric juice and bile solution. Int J Food Microbiol 86:293-301.
Mosilhey SH. 2003. Influence of different capsule materials on the physiological properties of microencapsulated lactobacillus acidophilus. Institute of Food Technology, Faculty of Agriculture University of Bonn. 153 pages.
Picot A, Lacroix C. 2004. Encapsulation of Bifidobacteria in whey protein-based microcapsules and survival in simulated gastrointestinal condition and in yoghurt. Int. Dairy Journal 14:505–515.
Seveline. 2005. Pengembangan produk probiotik dari isolat klinis bakteri asam laktat dengan menggunakan teknik pengeringan semprot dan pengeringan beku [tesis]. Bogor: Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
Sultana K, Godward G, Reynolds N, Arumugaswamy R, Peiris P, Kailasapathy K. 2000. Encapsulation of probiotic bacteria with alginate -starch and evaluation of survival in simulated gastro intestinal condition and in yoghurt. Int J Food Microbiol 62:47–55.
Sun W and Griffiths MW. 2000. Survival of Bifidobacteria in yogurt and simulated gastric juice following immobilization in gellan – xanthan beads. Int J Food Microbiol 61:17-25.
Wu W, Roe WS, Gimino VG, Seriburi V, Martin DE, Knapp SE. Balchem Corp. 28 November 2000. Low melt encapsulation with high laurate canola oil. US. Patent 6 153 326.
Yulianto E. 2004. Uji viabilitas dan fisiologis Lactobacillus sp. sebagai minuman probiotik penurun kolesterol dalam bentuk ser buk [skripsi]. Yogyakarta: Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada.
