Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2011 – Mei 2012 di
Laboratorium Lingkungan Departemen Budidaya Perairan FPIK IPB Bogor. Analisa parameter perlakuan dilakukan di lab. Lingkungan Departemen Budidaya Perairan FPIK dan lab. Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan ammonium klorida dan sodium nitrit yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari PT. Brataco Bogor. Bahan lain yang dibutuhkan adalah kalsium karbonat dan bioball. Ikan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan mas, dengan berat rata-rata 5±0,42 g/ekor. Ikan mas yang digunakan berasal dari satu induk yang diperoleh dari pembudidaya ikan mas di Bogor. Pakan yang diberikan merupakan pakan komersial untuk ikan mas. Wadah percobaan menggunakan akuarium sebanyak 24 buah dengan dimensi 20x20x20
cm3 dan diisi air sebanyak 4 liter.
Rancangan Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen dengan menggunakan pola Rancangan Acak Lengkap (RAL) Faktorial dengan
perlakuan kombinasi bahan (NH4Cl & NaNO2) dengan dosis berbeda dan
perbedaan waktu inkubasi sebelum ikan dimasukkan. Dosis bahan (NH4Cl &
NaNO2) yang digunakan mengacu pada dosis yang disarankan oleh Forteath
(1993). Lama pengamatan perlakuan adalah 21 hari. Faktor A :
Perlakuan A : Tanpa penambahan ammonium klorida dan sodium nitrit (kontrol)
Perlakuan B : Dosis ammonium klorida dan sodium nitrite (23 mg/l dan 37 mg/l)
Perlakuan C : Dosis ammonium klorida dan sodium nitrite (46 mg/l dan 74 mg/l)
Perlakuan D : Dosis ammonium klorida dan sodium nitrit (92 mg/l dan 148 mg/l)
Faktor B :
Perlakuan 1 : ikan dimasukkan tiga hari setelah bahan dimasukkan Perlakuan 2 : ikan dimasukkan enam hari setelah bahan dimasukkan
Maka kombinasi perlakuannya adalah :
A1 : Tanpa penambahan ammonium klorida dan sodium nitrit, ikan dimasukkan tiga hari setelah bahan dimasukkan
A2 : Tanpa penambahan ammonium klorida dan sodium nitrit, ikan dimasukkan enam hari setelah bahan dimasukkan
B1 : Dosis ammonium klorida dan sodium nitrite (23 mg/l dan 37 mg/l), ikan dimasukkan tiga hari setelah bahan dimasukkan
B2 : Dosis ammonium klorida dan sodium nitrite (23 mg/l dan 37 mg/l), ikan dimasukkan enam hari setelah bahan dimasukkan
C1 : Dosis ammonium klorida dan sodium nitrite (46 mg/l dan 74 mg/l), ikan dimasukkan tiga hari setelah bahan dimasukkan
C2 : Dosis ammonium klorida dan sodium nitrite (46 mg/l dan 74 mg/l), ikan dimasukkan enam hari setelah bahan dimasukkan
D1 : Dosis ammonium klorida dan sodium nitrit (92 mg/l dan 148 mg/l), ikan dimasukkan tiga hari setelah bahan dimasukkan
D2 : Dosis ammonium klorida dan sodium nitrit (92 mg/l dan 148 mg/l), ikan dimasukkan enam hari setelah bahan dimasukkan
Model linier dari rancangan ini adalah sebagai berikut :
Yijk = µ + αi + βj + (αβ )ij + εijk ; i =] 1, 2, 3, 4
j = 1, 2
k = 1,2,3
Dimana :
Yijk = variabel yang akan dianalisis
µ = rata-rata umum
βj = pengaruh kelompok ke-j
εijk = pengaruh acak pada perlakuan ke-i dan kelompok ke-j
Prosedur Penelitian Penelitian Pendahuluan
Penelitian pendahuluan dilakukan dengan tujuan untuk melihat efek bahan (ammonium klorida dan sodium nitrit) yang akan digunakan terhadap ikan uji. Penelitian pendahuluan ini juga dilakukan untuk penentuan padat tebar ikan yang akan digunakan.
Persiapan Penelitian
Ikan mas yang akan digunakan sebagai ikan uji, diaklimatisasi terlebih dahulu sebelum diberi perlakuan. Akuarium yang akan digunakan dicuci bersih dan dikeringkan. Air dari bak tandon yang akan digunakan disiapkan selang beberapa hari sebelum penelitian dimulai. Selain itu, air dari bak tandon ini juga tidak dikaporit atau diberi tawas untuk mencegah ketiadaan bakteri. Bioball yang akan digunakan diaktifasi terlebih dahulu agar dapat menjadi substrat bagi pertumbuhan bakteri nitrifikasi menggunakan ammonium klorida (46 mg/l) dan sodium nitrit (73 mg/l) mengacu pada dosis yang disarankan oleh Forteath (1993). Sehari sebelum penelitian dimulai, air dimasukkan kedalam akuarium penelitian diberi aerasi untuk meningkatkan kadar oksigen terlarut dalam air, ditambahkan
CaCO3, dan bioball yang telah diaktifasi.
Penelitian Utama
Ammonium klorida dan sodium nitrit yang telah ditimbang sesuai perlakuan dimasukkan kedalam akuarium penelitian (20x20x20cm3, volume 4 liter). Ikan mas yang digunakan sebagai ikan uji (dengan berat rata-rata 5±0,42 g/ekor) dimasukkan kedalam akuarium penelitian dengan kepadatan 3 ekor/liter sesuai dengan kelompok perlakuan masing-masing. Ikan diberi makan secukupnya dengan frekuensi pemberian pakan 2 kali sehari. Penelitian utama dilaksanakan selama 21 hari. Pengamatan parameter perlakuan dilakukan dengan interval waktu 3 hari.
Parameter yang Diamati
Parameter yang diamati adalah jumlah bakteri, ammonia, nitrit, nitrat, pH, suhu, oksigen terlarut, kesadahan dan tingkat kelangsungan hidup.
Evaluasi Parameter
Parameter Pengamatan
1. Jumlah Bakteri Total
Penghitungan jumlah total bakteri dilakukan dengan menggunakan Metode Plate Count (MPC). Sampel air yang diuji total bakterinya dicuplik sebanyak 100 mL, kemudian dipipet sebanyak 0,1 mL dan
dilakukan pengenceran hingga 107 sehingga diperoleh 7 tabung sampel
yang akan diuji total bakterinya. Sampel dari masing-masing tabung diambil sebanyak 100µL dan disebarkan dalam cawan petri yang mengandung media TSA. Setelah itu sampel diinkubasikan selama 48 jam
dengan suhu 25oC. Total bakteri dihitung dengan menggunakan rumus :
Total bakteri = faktor pengencer x ∑koloni
2. Jumlah bakteri AOB dan NOB
Metode yang digunakan untuk menghitung kelimpahan bakteri penghasil senyawa amonium dan nitrit adalah metode Most Probable Number (MPN). Sampel yang akan diuji dibuat dalam 10 seri tabung pengenceran. Setiap 1 mL sampel pengenceran diinokulasikan ke dalam tabung tiga seri untuk diinkubasikan. Kelimpahan bakteri dihitung
berdasarkan nilai pada Tabel MPN (USFDA Bacterial Analytical
Manual).
Media yang digunakan untuk bakteri nitrifikasi adalah:
Media AOB / Ammonium Oxidizing Bacterium (Bhaskar & Charluyu,
2005) :
(NH4)2SO4 0,235 g
KH2PO4 0,2 g
MgSO4.7H2O 0,04 g
FeSO4.7H2O 0,005 g
NaEDTA.7H2O 0,005 g
Air distilasi 1000 ml
Media ini dipanaskan, kemudian dimasukkan ke dalam test tube masing-masing 9ml, selanjutnya disterilisasi di dalam autoclave. Pertumbuhan bakteri AOB dikonfirmasi dengan perubahan warna dari putih bening menjadi merah (pink) setelah ditetesi reagen sulfanilamid dan NED.
Media NOB / Nitrite Oxidizing Bacterium (Bhaskar & Charluyu, 2005) :
NaNO2 0,06 g KH2PO4 0,2 g CaCl22H2O 0,04 g MgSO4.7H2O 0,04 g FeSO4.7H2O 0,005 g NaEDTA.7H2O 0,005 g Air distilasi 1000 ml
Media ini dipanaskan, kemudian dimasukkan ke dalam test tube masing-masing 9ml, selanjutnya disterilisasi di dalam autoclave. Pertumbuhan bakteri NOB dikonfirmasi dengan tidak terjadinya perubahan warna media setelah ditetesi reagen sulfanilamid dan NED.
3. Ammonia
Ammonia diukur dengan menggunakan metode phenate (APHA 1989). Sampel air sebanyak 25 mL diambil dari masing-masing akuarium. Kemudian pipet 10 mL air sampel dan masukkan ke dalam gelas piala. MnSO4 diteteskan sebanyak 1 tetes, chlorox 0,5 mL dan Phenate 0,6 mL, lalu homogenkan. Siapkan larutan standar (10 mL ammonia 0,30 ppm) dan blanko (10 mL akuades). Biarkan 15 menit hingga terbentuk warna biru yang stabil. Ukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 630 nm. Untuk menentukan konsentrasi ammonia
nitrogen, dibuat grafik atau persamaan regresi dari larutan standar.
Konsentrasi ammonia tak terionisasi (NH3) dihitung dengan mengkalikan
dengan faktor konversi (pada Tabel ammonia).
4. Nitrit
Kadar nitrit diukur dengan menggunakan metode Sulfanilamide (APHA 1989). Sampel air sebanyak 10 mL dimasukkan ke dalam gelas piala. Teteskan sulfanilamide sebanyak 0,2 mL (±4 tetes), lalu biarkan selama 2-4 menit. Tambahkan 0,2 mL (±4 tetes) NED, aduk sampai homogen. Kemudian dibuat larutan blanko dari 10 mL akuades. Nilai absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 543 nm. Untuk menentukan konsentrasi nitrit nitrogen, dibuat grafik atau persamaan regresi dari larutan standar.
Kosentrasi nitrit diperoleh dengan rumus :
NO2- (mg/L) = [NO2-N] x 3,28
5. Nitrat
Pengukuran kadar nitrat menggunakan metode Reduksi Cadmium (APHA 1989). Sampel diambil sebanyak 25 mL, ditambah 75 mL larutan
NH4Cl-EDTA dan campuran. Kemudian campuran sampel dituangkan ke
dalam kolom dan mulai dikumpulkan pada tingkat 7-10 mL/menit. Sebanyak 25 mL yang pertama dibuang, sisanya dikumpulkan di botol sampel. Reagen warna sebanyak 2,0 mL ditambahkan untuk 50 mL sampel dan campuran. Setelah itu, dibuat satu seri larutan standar. Nilai absorbansinya diukur pada panjang gelombang 543 nm terhadap reagen
akuades. Bandingkan setidaknya satu NO2- standar untuk mereduksi NO3-
standar pada konsentrasi yang sama untuk memverifikasi efisiensi kolom reduksi. Lalu dibuat kurva standar dengan memplotkan absorbansi standar
terhadap konsentrasi NO3-N. Konsentrasi sampel dihitung langsung dari
6. pH
Pengukuran pH dilakukan in situ dengan menggunakan pHmeter.
7. Suhu
Pengukuran suhu dilakukan in situ dengan menggunakan Thermometer.
8. Oksigen Terlarut
Pengukuran kandungan oksigen terlarut dilakukan in situ dengan menggunakan DOmeter.
9. Kesadahan Ca2+
Kesadahan Ca2+ diukur dengan menggunakan metode titrasi.
Sampel sebanyak 100 mL dimasukkan ke dalam erlenmeyer, ditambah 4
mL NaOH 1N, aduk, tambahkan 0,1 – 0,2 g murexide, aduk. Kemudian
titrasi dengan Na-EDTA hingga terjadi perubahan warna dari merah (pink) ke ungu. Nilai kesadahan dihitung menggunakan rumus :
10.Tingkat Kelangsungan Hidup (Sintasan)
Tingkat kelangsungan hidup ikan diketahui dengan
membandingkan jumlah ikan yang hidup di awal penelitian dengan jumlah ikan yang tersisa di akhir penelitian. Tingkat kelangsungan hidup dihitung berdasarkan rumus :
Nt : Jumlah ikan diakhir penelitian No : Jumlah ikan diawal penelitian
Kesadahan Ca2+ = mL titran x M titran x 100,1 x 1000 mL sampel
Nt
No
Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan uji F untuk mengetahui pengaruh dari setiap perlakuan. Perbedaan antar perlakuan diketahui dengan menggunakan uji jarak berganda Duncan pada taraf 5%.