Kemampuan bakteri endofit dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen R. solanacearum merupakan langkah pertama dalam pemilihan agen biokontrol potensial. Hasil pengujian secara in vitro menunjukkan, dari 222 isolat bakteri endofit yang diperoleh terdapat 39 atau 18 % di antaranya mampu memproduksi bakteriosin atau bersifat antibiosis, sedangkan 82 % sisanya tidak bersifat antibiosis (Gambar 2).
Gambar 2 Persentase bakteri endofit bersifat antibiosis hasil koleksi (a), dari
tanaman jahe, kencur, tomat, dan jagung (b) Terbentuknya zona bening (hambatan) di sekitar koloni bakteri endofit mengindikasikan adanya senyawa antibiotik yang dikeluarkan oleh bakteri endofit yang diuji untuk menghambat perkembangan bakteri patogen R. solanacearum penyebab penyakit layu pada tanaman jahe. Hal ini menunjukkan bakteri endofit tersebut mempunyai mekanisme penekanan secara antibiosis.
82% 18%
Bakteri endofit
non antibiosis antibiosis
a 0 20 40 60 80 100
Jahe Kencur Tomat Jagung
Endofit Antibiosis
Gambar 3. Zona hambatan bakteri endofit dengan R. solanacearum (a) dan koloni R. solanacearum pada media TTZA (b)
Bakteri endofit mampu menekan bakteri patogen R. solanacearum secara in vitro karena pada kondisi laboratorium, bakteri endofit hanya berhadapan dengan patogen dalam lingkungan yang kaya nutrisi, sehingga muncul potensinya dalam menghambat perkembangan patogen.
Zona hambatan yang terbentuk bervariasi, dengan diameter hambatan berkisar antara 3 mm sampai 24 mm. Bakteri endofit yang menunjukkan sifat antibiosis paling tinggi berasal dari tanaman jagung (41,03 %), berturut-turut diikuti isolat dari tanaman jahe (28,20 %), tomat (25,64 %), dan kencur (5,13 %). Diameter hambatan dikelompokkan dengan kategori lemah (1 – 8 mm), sedang (9-16 mm), dan kuat (17-24 mm). Walaupun isolat dari tanaman jahe termasuk ke dalam urutan kedua setelah jagung, tapi sifat antibiosis yang dimiliki mayoritas bersifat lemah (Tabel 2).
Tabel 2. Diameter zona hambatan isolat bakteri endofit penghasil bakteriosin. Diameter zona hambatan (mm)
Asal 1-8 mm (Lemah) 9-16 mm (Sedang) 17-24 mm (Kuat) Total (%) Isolat Jumlah (%) Jumlah (%) Jumlah (%)
Jahe 7 63,6 3 27,3 1 9,1 11 (28,20)
Kencur 2 0 0 0,0 0 0,0 2 ( 5,13)
Tomat 6 60,0 3 30,0 1 10,0 10 (25,64)
Jagung 6 37,5 7 43,8 3 18,8 16 (41,03)
21 54 13 33 5 13 39
Diameter zona hambatan yang terbentuk dari kelompok kuat (13 %) dan sedang (33 %) terbanyak dari tanaman jagung, sedangkan kelompok lemah (54 %) dari tanaman kencur dan jahe (Gambar 4). Sifat menonjol dari bakteri endofit adalah kemampuannya untuk hidup dalam jaringan tanaman, sifat antagonisme terhadap patogen dan kemampuan untuk menginduksi ketahanan (Nejad dan Johnson 2000).
Gambar 4 Persentase kelompok diameter hambatan bakteri endofit antibiosis
hasil koleksi (a) dari tanaman jahe, kencur, tomat, dan jagung (b) Antibiosis merupakan salah satu mekanisme penghambatan pertumbuhan
patogen oleh agens antagonis dan berperan penting dalam mengendalikan penyakit tanaman di lapangan (Ryder dan Mc.Clure 1997). Bakteri endofit yang
54% 33%
13%
lemah sedang kuat
a 0 20 40 60 80 100
Jahe Kencur Tomat Jagung
lemah
sedang
kuat
diisolasi dari tanaman kentang dan jagung dilaporkan dapat mengendalikan patogen, dengan mekanisme pengendalian menghasilkan senyawa antibiosis (Hinton dan Bacon 1995).
Antibiotik yang dihasilkan agens antagonis menyebabkan pertumbuhan patogen terhambat. Antibiotik phenazine-1-1 carboxylate yang dihasilkan P. fluorescens 2-79 dapat aktif pada media yang kekurangan unsur Fe, seperti pada media KBA sehingga dapat menekan pertumbuhan patogen (Thomashow dan Weller 1998). P. cepacia menghasilkan antibiotik phenazine carboxylic acid juga senyawa pengikat besi cephabactin (Meyer et al. 1989). Bacillus sp strain Ba-118 dan P. putida strain pf-20 telah dilaporkan menunjukkan aktivitas antibiosis secara in vitro terhadap R. solanacearum bakteri patogen penyebab layu pada tanaman tembakau. Kedua bakteri tersebut juga mampu menekan perkembangan penyakit layu bakteri baik di rumah kaca maupun di lapangan (Arwiyanto dan Hartana 2001).
Kebaradaan bakteri endofit dalam tanaman jagung sudah banyak diteliti dan diuji potensinya sebagai agens hayati. Eliza (2004), melaporkan bahwa peluang terbesar dari bakteri yang diisolasi dari empat jenis tanaman dengan kemampuan antibiosis tertinggi didapatkan dari bakteri endofit akar jagung yaitu sebesar (37,9 %).
Bakteri endofit sebagai pemacu pertumbuhan tanaman (PGPR)
Bakteri endofit yang mampu menghambat perkembangan R. solanacearum secara invitroselanjutnyadiseleksi potensinya dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman secara in vivo pada tanaman mentimun di rumah kaca (Gambar 5).
Hasil pengujian 39 isolat bakteri endofit antibiosis dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman secara in vivo pada tanaman mentimun menunjukkan bahwa, beberapa isolat bakteri endofit mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman. Kemampuan isolat bakteri endofit dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman disajikan pada Tabel 3.
Gambar 5 Pertumbuhan bibit mentimun yang diberi perlakuan bakteri endofit
Hasil pengamatan menunjukkan tidak semua isolat bakteri endofit bersifat antibiosis yang diuji mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman mentimun dibandingkan dengan tanaman kontrol (yang bernilai minus tidak mampu meningkatkan pertumbuhan). Peningkatan pertumbuhan tanaman tertinggi terdapat pada tanaman mentimun yang beri perlakuan isolat bakteri endofit antibiosis yang berasal dari tanaman jagung, yaitu sebesar 35,96 % diikuti dari tanaman tomat (33,40 %), dan tanaman jahe (31,34 %). Peningkatan pertumbuhan ini diduga karena keberadaan bakteri endofit yang menyebabkan jumlah akar dan panjang akar lateral meningkat dan memacu pertumbuhan tanaman. Akar lateral dapat memperluas daerah penyerapan unsur hara oleh tanaman sehingga kebutuhan nutrisi lebih cepat terpenuhi dan mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman (Vasudevan et al. 2002).
Isolat bakteri endofit yang dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman mentimun dengan persentase tertinggi dibandingkan dengan kontrol yang akan diuji lebih lanjut potensinya sebagai agens hayati terhadap R. solanacearum pada tanaman jahe. Pemilihan tersebut sejalan dengan pendapat Kloepper et al. (1999), bahwa mayoritas agens hayati yang berpotensi memiliki kemampuan dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman dan meningkatkan ketahanan tanaman.
Tabel 3. Persentase peningkatan pertumbuhan bibit mentimun mentimun pada umur 7 hari setelah diberi perlakuan bakteri endofit.
Panjang akar Jumlah akar lateral Peningkatan*)
Perlakuan Panjang (cm) Peningkatan (%) Jumlah Peningkatan (%) Pertumbuhan (%)
Kontrol 3,76 0,00 10,37 0,00 0,00 EJH1 4,01 6,65 10,7 3,18 9,83 EJH2 4,21 11,97 11,1 7,04 19,01 EJH3 3,85 2,39 10,1 -2,60 -0,21 EJH4 4,23 12,50 11,5 10,90 23,40 EJH5 4,29 14,10 11,4 9,93 24,03 EJH6 4,53 20,48 11,5 10,90 31,38 EJH7 4,16 10,64 11,3 8,97 19,61 EJH8 4,29 14,10 11,1 7,04 21,14 EJH9 4,19 11,44 11,4 9,93 21,37 EJH10 4,11 9,31 10,2 -1,64 7,67 EJH11 3,74 -0,53 10 -3,57 -4,10 EK1 4,09 8,78 10,5 1,25 10,03 EK2 4,04 7,45 10,4 0,29 7,74 ET1 4,23 12,50 10,7 3,18 15,68 ET2 4,31 14,63 10,8 4,15 18,77 ET3 4,36 15,96 11,1 7,04 23,00 ET4 4,38 16,49 11,2 8,00 24,49 ET5 3,72 -1,06 9,9 -4,53 -5,60 ET6 3,93 4,52 10 -3,57 0,95 ET7 4,22 12,23 11,2 8,00 20,24 ET8 4,17 10,90 11,3 8,97 19,87 ET9 4,57 21,54 11,6 11,86 33,40 ET10 4,25 13,03 11,4 9,93 22,96 EJG1 4,22 12,23 10,8 4,15 16,38 EJG2 3,89 3,46 10,1 -2,60 0,85 EJG3 4,3 14,36 11,5 10,90 25,26 EJG4 4,04 7,45 11,2 8,00 15,45 EJG5 3,98 5,85 10,9 5,11 10,96 EJG6 3,97 5,59 10,3 -0,68 4,91 EJG7 4,19 11,44 10,6 2,22 13,65 EJG8 4,32 14,89 11,3 8,97 23,86 EJG9 4,16 10,64 11 6,08 16,71 EJG10 4,37 16,22 11,4 9,93 26,16 EJG11 3,79 0,80 10,1 -2,60 -1,81 EJG12 4,07 8,24 11,1 7,04 15,28 EJG13 4,1 9,04 10,8 4,15 13,19 EJG14 4,63 23,14 11,7 12,83 35,96 EJG15 4,42 17,55 11,3 8,97 26,52 EJG16 4,31 14,63 11,2 8,00 22,63
*) Peningkatan pertumbuhan akar dihitung dari jumlah peningkatan panjang dan jumlah akar dibandingkan dengan kontrol
Hasil seleksi pada Tabel 3 menunjukkan terdapat tiga isolat bakteri endofit yang mampu meningkatkan pertumbuhan perakaran tanaman mentimun tertinggi. Ketiga isolat tersebut berasal dari tanaman jahe (EJH6), tomat (ET9), dan jagung (EJG14) yang selanjutnya akan digunakan dalam uji potensi dalam menekan perkembangan penyakit layu bakteri R. solanacearum pada tanaman jahe di rumah kaca.
Mekanisme utama peningkatan pertumbuhan adalah mekanisme penyerapan nutrisi oleh tanaman. Keberadaan bakteri pemacu pertumbuhan tanaman menyebabkan tanaman mampu menyerap nutrisi makro maupun mikro lebih baik. Mekanisme lainnya adalah yang berkaitan dengan kemampuan dalam memproduksi hormon pertumbuhan, siderophore yang dapat mengikat ion Fe dan membuatnya tersedia bagi perakaran tanaman, serta kemampuan melarutkan mineral P (Nelson 2004).
Salamone et al. 2001 melaporkan bahwa P. fluorescens dapat menghasilkan hormon pertumbuhan sitokinin, tiga jenis sitokinin yang dihasilkan adalah sitokinin dihydrozeatin riboside (DHZR), isopentenyladenosine (IPA), dan trans-zeatin ribose (ZR). Hormon pertumbuhan yang dihasilkan oleh bakteri juga dapat dimanfaatkan oleh tanaman untuk meningkatkan pertumbuhan tanaman.
Karakterisasi morfologi dan fisiologi bakteri endofit
Isolat bakteri endofit antibiosis yang berpotensi meningkatkan pertumbuhan tanaman terbaik dikarakterisasi dan diidentifikasi, untuk digunakan dalam pengujian induksi ketahanan di rumah kaca.
Hasil karakterisasi morfologi dan fisiologi bakteri endofit dari tiga isolat terpilih hasil seleksi antibiosis dan PGPR yang berasal dari tanaman jahe, tomat dan jagung disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Karakter morfologi dan fisiologi bakteri endofit isolat EJH6, ET9, dan EJG14
Karakter EJH6 ET9 EJG14
Gram positif negatif negatif
Warna Koloni putih putih kekuningan putih kekuningan Pigmen fluorescens tidak berpendar berpendar berpendar
Endospora berspora tidak berspora tidak berspora Uji O/F tidak diuji oksidatif oksidatif
Hidrolisis arginin tidak diuji positif positif Reaksi Hipersensitif negatif negatif negatif
Hasil pengamatan menunjukkan tiga isolat yang dikarakterisasi terbagi dalam dua kelompok yang berbeda. Terdapat dua isolat (ET9 dan EJG14) termasuk kedalam kelompok P. fluorescens dan satu isolat (EJH6) kelompok Bacillus.
Koloni ET9 dan EJG14 berwarna putih kekuningan pada media King’s B agar, dan berfluorescens dengan warna kuning kehijauan dibawah sinar ultra violet. Kedua isolat bakteri tersebut termasuk kedalam kelompok bakteri fluorescens. Sebagaimana dikemukakan oleh Goto (1992), bahwa fluorescensi dihasilkan oleh pigmen fluoresesns, yaitu senyawa fluoresein atau pioverdin yang terbentuk apabila bakteri tumbuh pada media yang kekurangan unsur besi, seperti KBA. Karakter Pseudomonas kelompok fluorescens yang berfluorescensi di bawah cahaya ultra violet memudahkan untuk membedakannya dengan kelompok bakteri lain.
Koloni EJH6 berwarna putih pada media SPA, tekstur kering tidak beraturan, dan tumbuh dengan cepat. Menurut Schaad et al. (2001), bahwa untuk membedakan karakter Bacillus dengan kelompok bakteri lainnya antara lain terbentuknya endospora dan gram positif.
(a) (b) (c)
Gambar 6 Ciri pertumbuhan bakteri endofit isolat EJH6 dari tanaman jahe (a), isolat ET9 dari tomat (b), dan EJG14 dari jagung (c).
Studi yang berfokus untuk mendapatkan bakteri pemacu pertumbuhan tanaman seringkali berhasil ditemukan pada genus Pseudomonas dan Bacillus. (Merriman et al. 1974.). Viswanathan et al. (2003) melaporkan P. fluorescens berhasil diisolasi dari tebu dan dan dari tanaman kentang Reiter et al. (2002).
Menurut Landa et al. (2002), kelompok bakteri antagonis yang banyak ditemukan di rizosfer dan dalam jaringan akar graminae adalah Bacillus spp, Paenibacillus, Pseudomas, dan Stenotrophomonas spp, dan Pseudomonas kelompok fluorescens (Larkin et al. 1996). Lemaga et al. (2001) melaporkan pada rizofer jagung ditemukan Pseudomonas cepacia yang bersifat antagonis terhadap R. solanacearum yang dapat menurunkan kerapatan populasi bakteri patogen ini.
Potensi bakteri endofit di rumah kaca
Isolat R. solanacearum (T 954) yang digunakan dalam pengujian bakteri endofit mempunyai virulensi yang tinggi, terlihat dari perkembangan gejala penyakit layu yang cepat pada tanaman jahe yang diinokulasi. Munculnya gejala awal penyakit layu bakteri, yang ditandai dengan daun menguning sudah terlihat pada hari ke-6 setelah inokulasi baik pada perlakuan kontrol positif (RS) maupun tanaman yang diberi perlakuan dengan tiga isolat bakteri endofit (Gambar 7).
Kejadian penyakit hari ke-7 setelah inokulasi, terendah (1,33 %) pada perlakuan EJH6 dan EJG14 yang tertinggi (8 %) pada perlakuan kontrol positif
(RS). Pada hari ke-35 setelah inokulasi, persentase kejadian penyakit pada semua perlakuan sudah mencapai 100 % .
Gambar 7 Kejadian penyakit layu bakteri pada tanaman jahe yang diaplikasi dengan bakteri endofit.
Hasil penelitin menunjukkan bahwa tanaman jahe yang diberi perlakuan bakteri endofit mampu menekan kejadian penyakit dan keparahan penyakit sebesar 83 % dibandingkan dengan tanaman kontrol tanpa perlakuan endofit pada hari ke 7 setelah inokulasi (Tabel 5).
Tabel 5. Indeks keparahan dan kejadian penyakit layu bakteri R. solanacearum pada tanaman jahe yang diaplikasi bakteri endofit di rumah kaca hari ke 7 dan 42 setelah inokulasi (hsi)
Perlakuan Keparahan penyakit (%) Penekanan penyakit (%) Kejadian penyakit (%) Penekanan penyakit (%)
7 hsi 42 hsi 7 hsi 42 hsi 7 hsi 42 hsi 7 hsi 42 hsi
EJH6 1,33 82,67b 83 17 7 100 83,0 0 ET9 2,67 90,67ab 67 9 13 100 68,3 0 EJG14 1,33 88,00ab 83 12 7 100 83,0 0 Kontrol 8,00 100a 0 0 40 100 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 7 14 21 28 35 42 kajadian penyakit (%) EJH6 ET9 EJG14 Kontrol Hari setelah inokulasi
Penekanan keparahan penyakit jahe berangsur-angsur menurun dengan bertambahnya umur tanaman dari 83 % pada 7 hari setelah inokulasi menjadi 12 % pada hari ke 42 (Gambar 8). Tingkat keparahan penyakit yang meningkat dengan cepat ini dikarenakan virulensi patogen yang tinggi dan lingkungan yang mendukung perkembangan patogen. Penekanan ini masih belum signifikan karena waktu tanam jahe di lapangan dapat mencapai 7 – 9 bulan sebelum panen.
Gambar 8 Grafik keparahan penyakit layu bakteri pada tanaman jahe yang diaplikasi dengan bakteri endofit.
Berkurangnya tingkat keparahan penyakit layu bakteri pada tanaman jahe disebabkan oleh adanya mekanisme pertahanan tanaman jahe yang terjadi akibat perlakuan bakteri endofit dan adanya infeksi challenge. Menurut Steiner & Schönbeck 1995, agens penginduksi akan diterima dan dikenali oleh reseptor tanaman yang berada diluar dan/atau pada membran sel. Agens penginduksi ketahanan bisa berperan sebagai sinyal itu sendiri atau hanya memicu sintesis sinyal tertentu yang ditransduksikan ke bagian tanaman lain. Sinyal tersebut diproduksi di satu bagian tanaman dan berperan di bagian lain. Transduksi sinyal dapat ditransfer secara intraseluler dan interseluler sehingga menyebabkan perlindungan sistemik. Beberapa sinyal yang terlibat dalam induksi ketahanan adalah asam salisilat (SA), asam jasmonat, sistemin, 2,6 dichloro-isonicotinic.
Ada beberapa kemungkinan alasan bakteri endofit belum mampu menekan perkembangan R. solanacearum pada tanaman jahe. Pertama,
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 7 14 21 28 35 42 keparahan penyakit (%) EJH6 ET9 EJG14 Kontrol Hari setelah inokulasi
perkembangan populasi bakteri patogen lebih cepat dibandingkan dengan populasi bakteri endofit, sehingga keberadaan bakteri endofit semakin tertekan dan belum mampu mengkolonisasi akar tanaman jahe. Sebagaimana dikemukakan oleh Kloepper et al. (1992), bahwa bakteri endofit harus mampu mengkolonisasi perakaran dan memproduksi suatu pemicu atau sinyal untuk menginduksi ketahanan dan ditranslokasikan secara sistemik sebelum ada infeksi patogen (challenge).
Alasan kedua adalah, ekspresi peningkatan ketahanan dari perlakuan bakteri endofit belum muncul pada waktu tanaman jahe diinokulasi R. solanacearum. Hasil penelitian Ibrahim (2009) pada kultur kalus jahe yang diperlakukan dengan senyawa kimia penginduksi ketahanan (asam salisilat) menunjukkan bahwa ekspresi ketahanan baru terlihat pada hari ke 30 setelah perlakuan asam salisilat.
Aktivitas antibakteri Bacillus spp dan Pseudomonas fluorescens terhadap R. solanacearum pada skala laboratorium, keberhasilannya pada skala rumah kaca dan lapang tidak konsisten (Supriadi dan Febriyanti 1995; Hartati et al. 1991). Hasil penelitian Mulya et al. (2000), menunjukkan bahwa aplikasi suspensi bakteri antagonis (Bacillus spp dan Pseudomonas fluorescens) belum mampu menekan laju perkembangan penyakit layu bakteri pada tanaman jahe di lapangan.
Chen et al. (1995) melaporkan bahwa aplikasi bakteri endofit yang diinjeksikan pada batang tanaman kapas dapat mengurangi busuk akar yang disebabkan oleh Rhizoctonia solani dan layu vaskular yang disebabkan oleh Fusarium oxysporum. Bakteri ini bergerak ke atas dan ke bawah membentuk titik aplikasi dan mengkolonisasi jaringan akar internal, dapat menghambat masuknya patogen dalam jaringan vaskular. Jadi bakteri endofit dapat keluar-berkompetisi dengan patogen. Dengan demikian, keberadaan populasi bakteri menguntungkan dalam rhizosphere tampaknya menjadi kunci untuk memperoleh keseimbangan microfloral dan tanaman sehat. Dalam kondisi lapangan, efektivitas dari agen biokontrol tergantung pada berbagai faktor seperti waktu aplikasi, umur tanaman, kekuatan formulasi agen biokontrol, cara penerapan dan berbagai faktor lainnya (Botelho dan Mendonca-Hagler 2006).
Menurut Raupach et al (1996), keberhasilan induksi ketahanan dapat ditentukan dari masa inkubasi, gejala, kejadian, dan keparahan penyakit.
Kemampuan bakteri endofit mengkolonisasi jaringan internal dan dapat berkembang dengan baik akan menghambat perkembangan patogen lebih optimal. Mekanisme bakteri endofit dalam mengendalikan penyakit diantaranya dengan mengkolonisasi relung ekologi patogen, terutama patogen penyebab penyakit pada jaringan pembuluh (Hallmann 2001).
Bakteri endofit masih berpeluang digunakan sebagai agens pengendalian hayati walaupun pada penelitian ini efektifitasnya baru pada skala laboratorium dan memperlambat munculnya gejala penyakit layu bakteri R. solanacearum pada tanaman jahe di rumah kaca. Untuk meningkatkan potensi bakteri endofit dalam mengendalikan penyakit layu bakteri pada tanaman jahe perlu dicari metode aplikasinya, seperti cara aplikasi (aplikasi pada benih maupun tanaman), waktu dan frekuensi aplikasi, dan formulasi yang tepat, sehingga bakteri endofit mampu mengkolonisasi akar dengan cepat.
KESIMPULAN
Bakteri endofit hasil isolasi dari tanaman tomat, jagung, dan temu-temuan diperoleh 222 isolat, 39 isolat (18 %) bersifat antibiosis, tiga diantaranya dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman mentimun di atas 30 % dibandingkan dengan kontrol dan termasuk dalam kelompok Bacillus sp dan P. Fluorescens. Secara umum hasil penelitian menunjukkan bahwa ketiga isolat bakteri endofit yang diuji dapat memperlambat munculnya gejala penyakit R. solanacearum pada tanaman jahe.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lanjutan, yaitu dengan melakukan pengamatan kemampuan bakteri endofit dalam mengkolonisasi akar yang akan digunakan sebagai dasar pemilihan agens pengendali hayati.