BAHAN DAN METODE
Perlakuan 12 bulan, dalam pakan aterogenik Monitor BB 4 bulan sekali dan lipid darah pada
Tahapan Persiapan
Pada tahap persiapan, hewan yang telah selesai karantina diovariektomi
kemudian diberi pakan aterogenik selama 15 bulan untuk menjadi
hiperkolesterolemik (kolesterol plasma > 200 mg/dL) dan terjadi aterosklerosis. Sebelum memasuki tahap selanjutnya, dilakukan pengambilan darah untuk pemeriksaan lipid yaitu kolesterol darah, kolesterol HDL, dan TG kemudian dikelompokan secara acak menjadi empat kelompok perlakuan.
Tahapan Perlakuan
Dalam tahap perlakuan, ke empat kelompok hewan diberi pakan aterogenik yang ditambahkan protein dan hormon sesuai kelompoknya selama 12 bulan (Tabel 4). Jumlah pakan yang diberikan untuk masing-masing hewan adalah 120 kalori/bobot badan per hari ditambah dengan 10% untuk perkiraan sisa. Komposisi lengkap dari ke-empat jenis pakan tersebut terdapat pada Lampiran 2 sampai dengan 5.
Tabel 4 Kelompok perlakuan berdasarkan komposisi pakan.
Kelompok Jumlah (Ekor) Protein (setiap 100 gram) EE-NETA (setiap 100 gram) KL 8 8.50 g - KL+EE-NETA 10 8.50 g 0.215 tablet* KDL 7 17.41 g - KDL+EE-NETA 8 17.41 g 0.215 tablet*
Keterangan: KL= kasein laktalbumin, EE-NETA= etinil estradiol-noretindron asetat, KDL= kedelai. * = dosis EE 0.33 µg/kg bobot badan dan NETA 0066 mg/kg bobot badan
Bobot badan seluruh hewan dimonitor setiap empat bulan sesuai dengan
penjadwalan pemeriksaan uji tuberkulinasi. Pada akhir tahap ini, sebelum
dilakukan tindakan cedera I/R miokardium, dilakukan pengambilan darah untuk pemeriksaan lipid yaitu total plasma kolesterol, kolesterol HDL, dan TG.
Tahapan Prosedur Iskemia dan Reperfusi (I/R) Miokardium
Setelah 12 bulan perlakuan, hewan percobaan disedasi dengan ketamin HCl (10 mg/kg bobot badan secara intramuskuler, IM) dan butorfanol asetat (0.05 mg/kg secara IM). Dalam keadaan sedasi, hewan diberikan alfa khloralose (100
mg/kg, secara intravena, IV) untuk mencapai anestesi pembedahan. Monyet
diventilasi dengan udara ruangan disuplementasi dengan oksigen.
Suatu monitor untuk mengamati tanda-tanda vital digunakan selama prosedur (Vetspecs® 9062, Canton, Georgia). Tanda-tanda vital yang dimonitor alat elektrokardiogram yaitu tekanan darah dan frekuensi denyut jantung. Hewan
diletakkan diatas heating pad (alas penghangat) untuk mempertahankan suhu
tubuh tetap normal. Cairan intravena dimasukkan melalui vena poplitea dengan
kateter vena. Kateter vena untuk pengukuran cardiac output (curah jantung)
dimasukkan melalui vena femoralis setelah dilakukan sayatan kecil di daerah
femoralis. Kateter tersebut dimasukkan sampai arteri pulmoner dan
pengukurannya memakai teknik termodilusi Swan Ganz kateter arteri pulmoner
(ukuran 5-French, panjang 75 cm Baxter, Santa Ana, California). Kateter
dimasukkan dengan dipandu fluoroskopi (Williams et al, 1995). Dengan
diketahuinya curah jantung dan frekuensi denyut jantung, maka volume sekuncup yaitu volume darah yang dikeluarkan oleh ventrikel per detik dapat dihitung dengan rumus yaitu curah jantung dibagi frekuensi denyut jantung. Kemudian, suatu kateter 3-French dimasukkan melalui arteri femoralis kanan dengan bantuan
fluoroskopi untuk menyuntikan mikrosfir sebagai pengukur aliran darah (blood
flow) miokardium.
Peubah hemodinamik lain yang diukur yaitu ejeksi ventrikel (diameter ventrikuler saat sistol dikurangi diameter ventrikel saat diastol) memakai Aloka 118 Colormetrics Medical Systems Echocardiography Machine dengan probe 5 MHz probe.
Torakotomi kiri dilakukan sehingga jantung tampak pada rongga interkostal.
Sebelum arteri koroner dioklusi, dilakukan pengukuran data dasar (baseline)
untuk aliran darah, curah jantung, denyut jantung, ejeksi ventrikel. Untuk
desendens dengan ligasi menggunakan benang pada bagian distal dari cabang pertamanya. Oklusi dipertahankan selama satu jam sebagai tahap iskemia, kemudian diukur ulang aliran darah, curah jantung, denyut jantung, dan ejeksi ventrikel. Setelah satu jam oklusi, ligasi dibuka kembali. Pembukaan oklusi ini merupakan tahap reperfusi miokardium dan pengukuran dilakukan setiap jam selama empat jam.
Tabel 5 Jenis parameter untuk fungsi miokardium yang diukur dan frekuensi
pengukurannya selama prosedur iskemia dan reperfusi Reperfusi
Peubah Pra
Iskemia Iskemia 1 jam 2 jam 3 jam 4 jam
Denyut jantung + + + + + + Curah jantung + + + + + + Volume sekuncup + + + + + + Aliran darah + + + Mieloperoksidase + + + Malondialdehida + + +
Tabel 5 menunjukkan variabel hemodinamik yang diukur dan frekuensi
pengukurannya selama prosedur iskemia dan reperfusi. Pada akhir reperfusi,
arteri kembali dioklusi dan diinjeksikan melalui sistem vena suatu larutan Evan’s blue 1% sehingga daerah yang beresiko dapat diidentifikasi dengan pewarnaan
negatif (negative staining). Hewan dietanasia dengan larutan KCl jenuh secara
intravena.
Jantung dengan cepat dikeluarkan dan ditimbang, selanjutnya diambil 0.3 g jaringan dari bagian beresiko iskemia (ventrikular kiri) dan juga bagian normal (ventrikel kanan) untuk analisis mieloperoksidase dan malondialdehida pada
miokardium. Sampel kemudian disimpan dalam suhu -70oC sampai siap untuk
dianalisis. Selanjutnya, jantung dipotong secara transversal pada setiap 3 mm dan potongan dimasukkan ke dalam larutan TTC 1% (Gambar 13).
Gambar 13 a) Jantung pascaiskemia dan reperfusi (panah menunjukkan arteri koronaria yang diligasi), b) Potongan transversal jantung tebal ± 3 mm.
Setelah 30 menit, jaringan didiperiksa untuk dipilah dan ditimbang menjadi bagian nekrotik (warna coklat terang) dan non nekrotik (warna kemerahan). Pemilahan dilakukan oleh peneliti dan dikonfirmasi oleh peneliti lain. Seluruh potongan jantung ditimbang dan dicatat sebagai luas infark dalam persentase yaitu jumlah gram daerah infark dibagi total jantung bagian iskemia.
Prosedur Nekropsi
Setelah selesai prosedur I/R miokardium, hewan dibawa ke ruang nekropsi. Selanjutnya, uterus dilepaskan di atas serviks dengan potongan transeksi. Berat
uterus dicatat dalam satuan gram dan kemudian difiksasi dalam neutral buffered
formalin(NBF) 10%. Kelenjar payudara dipotong secara sagitalis melalui puting susu sepanjang 3 cm dan difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 24 jam kemudian diganti dengan 70% etanol.
Pengukuran MPO dan MDA
Sampel yang dianalisis untuk aktivitas MPO dan MDA dari jaringan
miokardium yang normal dan daerah iskemia. Jaringan miokardium tersebut
dibekukan dalam nitrogen cair dan disimpan pada suhu -70oC sampai siap untuk
dianalisis.
MPO merupakan hemoprotein yang terdapat dalam granul netrofil yang dilepas ke media ekstraseluler dan pengukurannya menjadi indeks aktivasi
neutrofil secara indirek pada jaringan miokardium Jaringan beku sebanyak
kurang lebih 200 mg dihomogenisasi di dalam larutan bufer heksadesiltri-
metilamonium bromid (HTAB). Kromogen o-dianisidin dihidroklorid
ditambahkan ke dalam supernatan yang telah ditambahkan larutan bufer kalium
fosfat dan H2O2 1%. Setelah penambahan kromogen segera dibaca dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm kemudian diulang kembali setelah 60 detik. Satu unit MPO adalah yang dibutuhkan untuk mengoksidasi 1
µmol o-dianisidin per menit pada suhu 25oC. Satuan dari MPO adalah unit/g
Aktifitas malondialdehida (MDA) dilakukan dengan pengukuran suatu Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) yang merupakan suatu pengukuran peroksidasi lipid, suatu indikator utama untuk stres oksidatif. Prinsip dari pemeriksaan ini adalah reaksi dua molekul asam tiobarbiturat (TBA) dan satu molekul MDA yang akan membentuk satu kromogen yang dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm. Kurang lebih 100 mg jaringan miokardium yang telah dibekukan selanjutnya dihancurkan dalam mortar yang telah didinginkan. Jaringan disuspensi dengan 1:10 v/v dalam NaCl fisiologis. Sampel disonikasi selama 15 detik pada 40V dan tanpa disentrifusi, seluruh sample digunakan untuk
dianalisis. Pembacaan dengan spektrofotometer pada 532 nm. Satuannya
diekspresikan sebagai nanomol TBARS (ekivalen MDA) per mg protein. MPO dan MDA dari darah juga dianalisis dengan teknik yang sama tetapi tanpa melalui
tahap persiapan sampel. Frekuensi pengukuran mieloperoksidase dan
moalondialdehida dapat dilihat pada tabel 5. Pengukuran Uterus dan Kelenjar Payudara
Progestogen memberi perlindungan terhadap uterus dari induksi estrogen dan protein kedelai tidak mempunyai efek stimulasi terhadap uterus maupun payudara, oleh karena itu kedua organ ini penting untuk dianalisa. Jaringan uterus dan kelenjar payudara dipotong menjadi 3 mm pada potongan transversal dan
ditanamkan dalam lilin parafin. Potongan 5 mikron masing-masing organ
ditempelkan pada masing-masing gelas preparat untuk diwarnai dengan hematoksilin eosin. Untuk analisis, preparat tersebut difotografi dengan kamera digital (Nikon Labophot II) melalui video kamera ditayangkan pada monitor
computer. Gambar yang tertangkap diukur memakai program Image Pro Plus
Version 5.1.
Daerah endometrial diukur sepanjang junction (peralihan) endometrium dan
miometrium dan konfirmasi dengan evaluasi histologik. Pengukuran endometrium
yaitu ketebalan (mm) (Gambar 14). Pengukuran kelenjar payudara dilakukan
pada satu kelenjar pada kedua sisi puting payudara (Gambar 15). Dua tipe
pengukuran yang dilakukan yaitu 1) total area dan 2)total area lobular (dermis,
adalah rataan dan simpang baku dari persentase payudara berbanding total area dan persentase payudara berbanding dengan area lobular.
Ketebalan endometrium
Gambar 14 Pengukuran ketebalan endometrium dari potongan uterus dengan pewarnaan hematoksilin eosin (10x).
Total lobular area Total area Total kelenjar/duktus
Puting payudara
Total lobular area Total area Total kelenjar/duktus
Total lobular area Total area Total kelenjar/duktus
Puting payudara
Gambar 15 Daerah kelenjar payudara yang diukur dari satu kelenjar payudara (Pembesaran 10x).
Analisis Statistik
Analisis dilakukan dengan suatu program Statistica Analysis (Tulsa,
Oklahoma, USA). Sebelum analisis, seluruh data dievaluasi distribusi dan homogenitas variansnya dalam kelompok. Transformasi statistik logaritma dilakukan agar distribusi data memenuhi kriteria normalitas dan homogenitas sehingga memperkecil bias perhitungan analisis variansnya. Sidik ragam 2-
faktorial (ProteinKasein,Kedelaix HormonEPT-,EPT+) digunakan untuk menentukan
pengaruh manipulasi percobaan pada dependent measures. Untuk parameter
yang mempunyai data awal (baseline) dan data selama eksperimen seperti
bobot badan dilakukan analisis kovarians (kovarian dengan nilai awal). Tingkat kepercayaan yang dipakai adalah 0.05. Seluruh nilai yang dilaporkan adalah rataan ± simpang baku.