BAB III METODE PENELITIAN
H. Alat dan Bahan Penelitian
I. Cara Kerja
1. Pembuatan Minyak Atsiri
a. Kulit batang kayu manis yang diperoleh di Pasar Beringharjo, Yogyakarta diserbuk kasar lalu ditimbang sebanyak 4.617 gram. Setelah itu dimasukkan ke dalam dandang destilasi yang telah diisi air sebanyak 9 liter, dirangkai dengan pendingin air dan penampung destilat. Kemudian dipanaskan dengan kompor LPG api sedang, pemanasan dihentikan setelah 6 jam sejak destilat pertama menetes lalu didinginkan. Dari proses ini, dihasilkan minyak atsiri kulit batang kayu manis dengan volume 4,5 ml.
b. Rimpang lengkuas yang didapatkan di Desa Margoagung, Seyegan, Kabupaten Sleman dicuci, diiris dengan ketebalan ± 5 mm, lalu ditimbang sebanyak 5.803 gram. Setelah itu dimasukkan ke dalam
commit to user
dandang destilasi yang telah diisi air sebanyak 7 liter, dirangkai dengan pendingin air dan penampung destilat. Kemudian dipanaskan dengan kompor LPG api sedang, pemanasan dihentikan setelah 6 jam sejak destilat pertama menetes lalu didinginkan. Dari proses ini, dihasilkan minyak atsiri rimpang lengkuas dengan volume 7,4 ml.
2. Preparasi Media Pembiakan
a. Untuk setiap 1 L akuades dibutuhkan 65 gr bubuk agar SDA.
b. Cawan petri yang digunakan adalah 3 cawan petri berdiameter 10 cm dan 1 cawan petri berdiameter 5 cm. Larutan agar dituang ke dalam cawan petri hingga tebalnya mencapai 4 mm.
c. Preparasi SDA:
Perhitungan jumlah larutan agar yang dibutuhkan untuk satu kali percobaan pada cawan petri berdiameter 10 cm:
z = R
= ( · 5R · 0,4) cm3
»31,43 cm3Û 31,43 ml
Satu cawan petri membutuhkan 31,43 ml larutan SDA, sehingga untuk 3 cawan dibutuhkan 94,29 ml larutan SDA.
Untuk cawan petri berdiameter 5 cm:
z = R
= ( · 2,5R· 0,4) cm3
commit to user
Setiap cawan dituangkan 7,86 ml larutan SDA.
Total untuk 1 kali percobaan dibutuhkan 102,15 ml larutan agar SDA. Dibuat dengan cara melarutkan 6,64 gram bubuk SDA ke dalam 102,15 ml akuades.
d. Preparasi Larutan Kloramfenikol
Penambahan larutan kloramfenikol ke dalam media SDA bertujuan untuk mencegah tumbuhnya kuman kontaminan. Setiap 1000 ml larutan SDA membutuhkan 400 mg kloramfenikol. Sehingga untuk
102,15 ml larutan SDA dibutuhkan: ą6R,ąō
ą666 x 400 mg =
40,86 mgkloramfenikol (Bridson, 1998).
Setiap 250 mg bubuk kloramfenikol yang didapatkan dari kapsul kloramfenikol 250 mg dilarutkan ke dalam 10 ml NaCl 0,9%.
Maka untuk 40,86 mg bubuk kloramfenikol, dibutuhkan:
6,
Rō6 x 10 ml = 1,63 ml akuades (Bridson, 1998).
e. Media SDA yang masih cair kemudian dibiarkan mendingin, lalu disterilisasi di dalam autoklaf pada suhu 118oC – 121oC selama 15 menit.
3. Preparasi Flukonazol
Flukonazol yang digunakan didapat dari kapsul dengan merk dagang diflucan yang mengandung 50 mg flukonazol. Hasil penelitian
commit to user
Peter (1996) menunjukkan bahwa flukonazol pada konsentrasi 25 µg merupakan konsentrasi optimal untuk menghambat pertumbuhan spesies
Candida albicans secara in vitro. Sehingga dalam penelitian ini digunakan dosis dengan konsentrasi 25 µg. Akuades yang dibutuhkan untuk mendapatkan flukonazol konsentrasi 25 µg adalah:
ązą = RzR 25 µg ·zą= 50 mg · 0,05 ml zą =ō6.666 6,6ō Rō zą = 100 ml
4. Pengenceran Minyak Atsiri
a. Minyak atsiri dari kulit batang kayu manis dan rimpang lengkuas dan campuran minyak atsiri dengan konsentrasi 100% diencerkan dengan etanol 70%. Penelitian ini menggunakan etanol 70% sebagai pengencer minyak atsiri, karena minyak atsiri mudah larut dalam etanol 70%, eter, eter minyak tanah, kloroform serta minyak lemak (Hargono et al., 1986)
b. Larutan minyak atsiri dengan berbagai konsentrasi didapatkan dengan perhitungan sesuai turunan persamaan pengenceran ązą = RzR, yaitu:
z
ą=
N1 = kadar flukonazol akhir N2 = kadar flukonazol awal V1 = volume awal
V2 = volume akhir
N1 = kadar minyak atsiri awal N2 = kadar minyak atsiri akhir V1 = volume awal
commit to user
c. Sebanyak 0,2 ml minyak atsiri 1% didapatkan dengan cara mencampur
2×10-3 ml minyak atsiri 100% dengan 1,98×10-1 ml etanol 70%. Diperoleh dari zą =ą% 6,R
ą66% = 2×10-3 ml
d. Sebanyak 0,2 ml minyak atsiri 4% didapatkan dengan cara mencampur
8×10-3 ml minyak atsiri 100% dengan 1,92×10-1 ml etanol 70%. Diperoleh dari zą = % 6ą66%,R
= 8×10-3 ml
e. Sebanyak 0,2 ml minyak atsiri 8% didapatkan dengan cara mencampur
1,6×10-2 ml minyak atsiri 100% dengan 1,84×10-1 ml etanol 70%. Diperoleh dari zą = % 6,R
ą66% = 1,6×10-2 ml
f. Sebanyak 0,2 ml minyak atsiri 12% didapatkan dengan cara
mencampur 2,4×10-2 ml minyak atsiri 100% dengan 1,76×10-1 ml etanol 70%. Diperoleh dari zą = ąR% 6,R
ą66% = 2,4×10-2 ml
g. Sebanyak 0,2 ml minyak atsiri 16% didapatkan dengan cara
mencampur 3,2×10-2 ml minyak atsiri 100% dengan 1,68×10-1 ml etanol 70%. Diperoleh dari zą = ą % 6ą66%,R
= 3,2×10-2 ml
commit to user
Seluruh rangkaian percobaan diulangi sebanyak 4 kali pada uji penelitian. Jumlah pengulangan didapatkan dengan rumus Federer :
( − 1)( − 1)≥ 15
(18− 1)( − 1) ≥ 15
(17 − 17)≥ 15
≥ 1,88
Jumlah ulangan percobaan yang dilakukan minimal 1,88 kali. Pada penelitian kali ini, peneliti melakukan ulangan percobaan sebanyak 4 kali.
Peneliti tidak melakukan uji pendahuluan karena telah ada penelitian sebelumnya yang menguji efek antifungi dari minyak atsiri kulit batang kayu manis dan rimpang lengkuas secara terpisah. Hasil yang didapatkan dari kedua penelitian itu menunjukkan bahwa KHM minyak atsiri kayu manis sebesar 1% dan rimpang lengkuas sebesar 8% (Sukandar, 1999; Soeratri, 2005). Oleh karena itu, penelitian ini menggunakan konsentrasi minyak atsiri yang dimulai dari 1% dan menyinggung 8%.
6. Uji Penelitian
a. Kultur koloni jamur Candida albicans berusia 2 hari diambil dengan oshe kolong lalu dilarutkan ke dalam NaCl 0,9%. Kekeruhannya distandarkan dengan 0,5 standar Mc Farland yang ekuivalen dengan kekeruhan larutan campuran antara 0,5 ml BaCl2•2H2O 1,175% dan 99,5 ml H2SO4 1% (Jorgensen, Turnidge, Washington, 1999).
k : jumlah perlakuan n : jumlah ulangan
commit to user
b. Suspensi Candida albicans diambil sebanyak 0,2 ml. Lalu diteteskan ke atas permukaan cawan petri. Suspensi jamur diratakan dengan cara menggoyang-goyangkan cawan petri dan usapan oshe kolong (Asiyani, 2008).
c. Untuk cawan petri diameter 5 cm, dibuat 2 buah sumuran berdiameter 6 mm. Pada sumuran pertama diisi 0,05 ml etanol 70% sebagai kontrol negatif dan pada lubang kedua diisi 0,05 ml larutan flukonazol 25 µg sebagai kontrol positif. Etanol 70% dipilih sebagai kontrol negatif karena tidak memiliki efek antifungi. Ini dibuktikan oleh tidak adanya zona hambat pada sumuran kontrol negatif yang diisi dengan etanol 70%. Sedangkan pada sumuran yang berfungsi sebagai kontrol positif yang diisi dengan larutan flukonazol 25 µg, terdapat zona hambatan yang berarti. Flukonazol telah terbukti bekerja tepat dan efektif untuk pengobatan infeksi jamur superfisial dan sistemik (Adiguna, 2000). d. Pada tiga cawan petri diameter 10 cm, masing-masing dibuat 5 buah
sumuran berdiameter 6 mm.
e. Ke dalam 5 sumuran pada cawan petri I, masing-masing diisi 0,05 ml larutan minyak atsiri kulit batang kayu manis konsentrasi 1%, 4%, 8%, 12% dan 16%.
f. Ke dalam 5 sumuran pada cawan petri II, masing-masing diisi 0,05 ml larutan minyak atsiri rimpang lengkuas konsentrasi 1%, 4%, 8%, 12% dan 16%.
commit to user
g. Ke dalam 5 sumuran pada cawan petri III, masing-masing diisi 0,05 ml campuran larutan minyak atsiri kulit batang kayu manis dan rimpang lengkuas konsentrasi 1%, 4%, 8%, 12% dan 16%.
h. Seluruh cawan petri lalu disimpan di dalam inkubator pada suhu 37oC selama 24 jam.
i. Pengukuran diameter zona hambatan dalam satuan mm dengan
menggunakan penggaris dengan ketelitian hingga 1 mm, termasuk diameter lubang sumuran (Pepeljnjak et al., 2005).