BAB 3 METODE PENELITIAN
3.6. Cara Kerja Penelitian
3.6.1. Pembuatan Ekstrak Daun Binahong
Sampel berupa daun binahong segar didapatkan dari pusat penjualan tanaman binahong di daerah Cisarua kemudian proses pengeringan daun juga dilakukan disana. Tahapannya sebanyak 4 kg daun binahong segar yang tidak terserang hama, penyakit, dan pencemar lainnya dibersihkan dengan air mengalir, kemudian ditiriskan. Selanjutnya dipotong menjadi bagian-bagian kecil dan dikeringkan dibawah sinar matahari sampai sampel tersebut benar-benar kering, proses ini membutuhkan waktu hingga tiga hari jika cuaca sedang tidak hujan.
Selanjutnya daun binahong kering sebanyak 530,6 gram dibawa ke Balai Tamanan Obat dan Aromatik (BALITRO) untuk dilakukan ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96% oleh tenaga laboratorium disana. Hasil yang didapat berupa ekstrak kental daun binahong sebanyak 26,2 gram. (Gambar lihat Lampiran 4).
3.6.2. Pembuatan Basis Salep
Pembuatan basis salep dilakukan sendiri oleh peneliti di Laboratorium Farmakologi. Basis salep yang akan digunakan adalah basis berlemak yaitu adeps lanae dan vaselin album. Sebelumnya adeps lanae dan vaselin album dipanaskan agar melebur diatas air yang mendidih menggunakan baker glass, cawan porselen, hot plate stirrer, dan spatula. Kemudian, adeps lanae dan vaselin album dicampur menggunakan lumpang dan alu yang sebelumnya disiram dengan menggunakan air panas dengan suhu 500C. Setelah itu campuran tersebut diaduk dengan kecepatan konstan hingga homogen dan terbentuk basis salep. Basis salep kemudian disimpan dalam tabung plastik dan ditutup (Gambar lihat Lampiran 4).
Pemilihan sediaan berbentuk salep dengan vaselin album dan adeps lanae sebagai basisnya adalah berdasarkan sifatnya yang dapat menutup luka dengan baik serta dapat menyerap air dalam luka sehingga
meningkatkan hidrasinya. Perawatan luka tertutup (occlusive dressing) dan hidrasi yang baik dapat menciptakan lingkungan luka yang lembab sehingga dapat memfasilitasi untuk mempercepat proses penyembuhan luka (moist wound healing).30
3.6.3. Pengujian Sediaan Salep
Pengujian sediaan salep juga dilakukan sendiri oleh peneliti di Laboratorium Farmakologi. Sediaan salep yang telah dibuat dilakukan uji berupa tes homogenitas. Tes homogenitas dilakukan dengan cara mengoleskan sediaan salep ekstrak daun binahong pada sekeping kaca transparan dimana sediaan diambil bagian atas, tengah dan bawah.31
3.6.4. Pembuatan Konsentrasi Salep Ekstrak Daun Binahong
Formula standar dasar basis salep yang digunakan adalah31 : R/ Adeps Lanae 15 g
Vaselin Album 85 g
m.f salep 100 g
Sediaan salep yang akan digunakan dalam penelitian ini memiliki konsentrasi masing-masing yaitu 10%, 20%, 40% dibuat sebanyak 30 g (Gambar lihat Lampiran 2).
Konsentrasi 10%
R/ Ekstrak daun binahong 3 g
Dasar salep 27 g
m.f salep 30 g
Konsentrasi 20%
R/ Ekstrak daun binahong 6 g
Dasar salep 24 g
m.f salep 30 g
Konsentrasi 40%
R/ Ekstrak daun binahong 12 g
Dasar salep 18 g
46
3.6.5. Etika Penelitian
Pelaksanaan penelitian ini telah disetujui oleh Komisi Etik Penelitian Kesehatan FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Sebelum diberikan perlakuan, terlebih dahulu 25 ekor tikus diadaptasikan dalam lingkungan animal house selama tujuh hari, kemudian dilakukan randomisasi dengan cara undian menjadi lima kelompok, dimana masing-masing kelompok terdiri dari lima tikus. Tikus ditempatkan di kandang yang sesuai dengan habitatnya. Setiap tikus dipisahkan dengan cara memasang sekat kawat sehingga kontak fisik antar tikus dapat dihindari. Bagian alas kandang diberi sekam kayu untuk menampung kotoran dan urin tikus, kemudian ditutup dengan menggunakan sekat kawat agar serbuk kayu tidak dapat mengkontaminasi luka pada pada punggung tikus. Pembersihan kandang selama perlakuan dilakukan setiap dua hari sekali. Selama percobaan, kelima kelompok tikus diberi makan pelet dan air secara ad libitum
Setelah dilakukan perlakuan selama 5 hari, pada hari ke-6 dilakukan terminasi dengan menggunakan inhalasi eter. Selanjutnya dilakukan pengambilan sampel jaringan kulit di bagian dorsal (Gambar lihat Lampiran 4). Sampel jaringan kemudian dibawa ke Laboratorium Patologi Anatomi FKUI. Bagian tubuh tikus yang tidak diambil untuk sampel jaringan dikuburkan.
3.6.6. Induksi Luka Bakar pada Tikus
Sebelum dilakukan pencukuran, sediakan toples yang berisi tissue yang telah diberi cairan eter sebagai anastesi. Masukkan tikus ke dalam toples, lalu tunggu beberapa saat sampai efek inhalasi eter terlihat yakni tikus akan terlihat melemas. Dibawah pengaruh anastesi, cukur bersih bagian punggung tikus dengan menggunakan gunting, krim cukur, serta pisau cukur untuk meminimalisir timbulnya iritasi pada kulit tikus.
Tikus kembali dianastesi dengan dimasukkan kedalam toples berisi eter sebelum dilakukan induksi luka bakar. Kemudian lakukan sterilisasi dengan alkohol 70% pada daerah punggung tikus yang telah dicukur. Induksi luka bakar pada tikus dilakukan menggunakan plat besi berukuran 4 x 2 cm2 yang dipanaskan dalam air mendidih (suhu ± 950C) selama 5 menit, lalu tempelkan plat besi pada kulit punggung tikus selama 30 detik. (Gambar lihat Lampiran 4).32
3.6.7. Pemberian Salep Ekstrak Daun Binahong
Pemberian salep dilakukan dengan cara mengoleskan di bagian luka pada punggung tikus dua kali sehari, yaitu di pagi dan sore hari, selama 5 hari dari hari ke-1 sampai hari ke-5 setelah induksi luka bakar. Sebagai pembanding digunakan kontrol negatif yaitu tikus yang diberi basis salep saja tanpa kandungan ekstrak daun binahong dan kontrol positif yang diberi Silver Sulfadiazine sebagai obat standar penanganan sebagian besar luka bakar yang sampai saat ini masih digunakan secara luas. (Gambar lihat Lampiran 4).
3.6.8. Eksisi Jaringan Kulit Tikus
Setelah 5 hari tikus diterminasi dengan menggunakan eter inhalasi. Setelah itu dilakukan eksisi pada seluruh ketebalan jaringan kulit yang diambil dari lokasi luka, kemudian difiksasi menggunakan larutan formalin 10% dan disimpan dalam tabung organ (Gambar lihat Lampiran 4).25
3.6.9. Pembuatan Preparat Histologi Jaringan Kulit Tikus
Jaringan kulit tersebut kemudian dibuat preparat histopatologi dengan metode blok paraffin denganpewarnaan Hemaktosilin-Eosin yang dilakukan di departemen Patologi Anatomi FKUI (Gambar lihat Lampiran 4).
48
Preparathistopatologi diamati dengan menggunakan mikroskop cahayaOlympus BX41 dengan perbesaran 100 kali kemudian difoto dengan menggunakan kamera mikroskop Olympus DP25 serta software Olympus DP2-BSW (Gambar lihat Lampiran 4). Data mikroskopis dalam hal ini berkaitan dengan proses re-epitelisasi epidermis dengan parameter yang digunakan adalah ketebalan lapisan re-epitelisasi epidermis. Dengan demikian didapatkan file foto preparat yang akan dihitung ketebalan lapisan re-epitelisasi epidermisnya menggunakan aplikasi ImageJ.
3.6.11. Penghitungan Ketebalan Lapisan Re-epitelisasi Epidermis
Penghitungan ketebalan lapisan re-epitelisasi epidermis dihitung menggunakan aplikasi ImageJ. Tahapannya adalah sebagai berikut :
a. Buka aplikasi ImageJ. b. Klik “File” pada menubar.
c. Klik “Open” dan masukkan file foto yang diinginkan.
d. Setelah file foto terbuka, klik “Straight” pada menu toolbar.
e. Buatlah garis lurus persis sepanjang penggaris yang terdapat pada bagian kanan bawah foto preparat histopatologi.
f. Klik “Analyze” pada menubar kemudian klik “Set Scale”.
g. Ketik ukuran panjang penggaris yang terdapat pada foto preparat
histopatologi pada kolom “Known Distance”, dalam penelitian ini adalah 100, kemudian satuannya dalam kolom “Unit of Length”,
dalam penelitian ini adalah µm. h. Klik “OK”.
i. Buatlah kembali garis lurus sepanjang ketebalan lapisan re-epitelisasi epidermis yang dikehendaki.
j. Klik “Analyze” pada menubar kemudian klik “Measure”.
k. Kemudian akan muncul halaman baru dengan judul “Result”, pada
penelitian ini data yang digunakan adalah yang terdapat pada kolom
“Length”.
l. Lakukan langkah a sampai k setiap kali akan mengukur ketebalan lapisan re-epitelisasi epidermis.
m. Apabila diperlukan, halaman “Result” dapat disimpan dengan cara
klik “File” kemudian klik “Save”.
Pada penelitian ini, penghitungan ketebalan lapisan re-epitelisasi epidermis dilakukan pada kedua tepi luka yang diamati pada preparat histopatologi. Pada masing-masing tepi luka diambil data ketebalan lapisan re-epitelisasi epidermisnya pada lima titik secara berurutan kemudian dihitung reratanya.
3.7. Managemen dan Analisis Data
Data histopatologis diolah dengan analisisOne WayANOVA. Pengolahan data menggunakan SPSS versi 16.