BAB III. METODE PENELITIAN
3.9. Cara Kerja Penelitian
a. Penerbitan Ethical Clearance
Pada tahap persiapan, pemeliti akan meminta penerbitan ethical clearance kepada komisi etik FakultasKedokteran Universitas Sumatera Utara.
b. Uji Coba Alat dan Bahan
Uji coba alat dilakukan untuk memastikan seluruh alat dan bahan yang akan digunakan dalam penelitian berfungsi dengan baik. Uji coba digunakan dengan memeriksa 10 sampel darah dari subyek yang sama (diluar subyek penelitian), kemudian hasilnya dianalisis dengan regresi linear untuk melihat linearitas kurva dan dihitung nilai koefisien varians (coefficient of variation) dari pemeriksaan 10 sampel tersebut.
2. Identifikasi subjek yang berpotensi masuk ke dalam penelitian Identifikasi subjek dilakukan oleh peneliti dengan menggunakan data umur dan indeks massa tubuh yang didapatkan dari skrining awal. Apabila subjek berpotensi menjadi sampel dalam penelitian, peneliti akan melakukan prosedur informed consent.
3. Informed consent
Informed consent dilakukan oleh peneliti. Peneliti akan menjelaskan seluruh prosedur penelitian yang akan dilakukan. Kesediaan ikut serta
dalam penelitian didokumentasikan dengan menandatangani formulir persetujuan. Subjek akan mendapatkan salinan lembar persetujuan. 4. Penilaian lebih lanjut
Subjek yang telah bersedia mengikuti penelitian dan telah menandatangani formulir persetujuan akan dinilai lebih lanjut kelayakannya untuk ikut serta dalam penelitian berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi.
5. Pengukuran Indeks Massa Tubuh dan Lingkar Pinggang
Indeks massa tubuh dihitung dengan membagi berat badan (Kg) dengan kuadrat tinggi badan (m2) dan dicatat 1 angka di belakang koma.
IMT = Ber atbadan( Kg)
Tinggibadan ( m )
a. Pengukuran berat badan
1. Alat timbang diletakkan di lantai yang rata/datar dan keras. 2. Alat timbang ditekan sampai menunjukkan angka 00,0
sebelum dilakukan penimbangan.
3. Memastikan subyek penelitian menggunakan pakaian yang tipis (kaos lengan pendek dan celana pendek), melepaskan alas kaki, tali pinggang, kacamata, dan mengeluarkan isi kantong (jika ada).
4. Meminta subyek penelitian untuk berdiri tegak di tengah-tengah alat timbang, mata/kepala lurus ke arah depan, dan
5. Setelah subyek berdiri dengan benar, secara otomatis alat timbang akan menunjukkan hasil penimbangan digital. 6. Subyek diminta untuk turun dari timbangan dan peneliti
mencatat hasil penimbangan tersebut.
7. Pengukuran berat badan dilakukan sebanyak tiga kali dan nilai rata-rata ketiga pengukuran itu dilaporkan sebagai berat badan. Berat badan dicatat 1 angka di belakang koma. b. Pengukuran tinggi badan
1. Stature meter ditempelkan di dinding dengan bagian yang lebih panjang menempel di lantai dan bagian yang lebih pendek menempel di dinding. Tarik meteran pengukur ke atas hingga terlihat angka nol pada garis merah di kaca pengukur yang menempel di lantai.
2. Ujung atas stature meter ditempelkan ke dinding dengan menggunakan paku.
3. Setelah memastikan bagian atas stature meter menempel dengan stabil, meteran pengukur dapat ditarik ke atas. 4. Subyek penelitian diminta untuk melepaskan alas kaki dan
berdiri menempel di dinding. Kedua kaki subyek berada di tengah-tengah stature meter.
5. Memastikan subyek berdiri tegak dengan tangan di samping, pandangan lurus ke depan dan garis pandang
sejajar dengan tanah, kaki lurus, tulang bahu, tumit serta betis menempel di dinding.
6. Subyek diminta menarik nafas panjang. Secara bersamaan, peneliti menurunkan meteran pengukur hingga pas di atas kepala subyek dan membaca angka di dalam kaca pengukuran.
7. Pengukuran tinggi badan dilakukan sebanyak tiga kali dan nilai rata-rata ketiga pengukuran itu dilaporkan sebagai tinggi badan. Tinggi badan dicatat 1 angka di belakang koma.
c. Pengukuran Lingkar Pinggang
1. Subyek penelitian diminta untuk melepaskan pakaian bagian atas, tali pinggang dan melonggarkan celana.
2. Ujung nol meteran diletakkan di atas tonjolan tulang panggul kanan (crista illiaca dextra), kemudian meteran dilingkarkan di perut secara horizontal dan sejajar dengan lantai.
3. Memastikan meteran kencang, tetapi tidak sampai menekan kulit perut.
4. Pasien diminta untuk menarik nafas dan mengeluarkan nafas. Lingkar pinggang diukur pada saat subyek mengeluarkan nafas (akhir ekspirasi).
5. Pengukuran lingkar pinggang dilakukan sebanyak tiga kali dan nilai rata-rata ketiga pengukuran itu dilaporkan sebagai lingkar pinggang. Lingkar pinggang dicatat 1 angka di belakang koma.
6. Pemeriksaan sampel darah a. Pengambilan sampel darah
Sampel darah diambil pada pagi hari (jam 08.00 – 09.00) setelah sampel penelitian puasa selama 10-12 jam.Darah sebanyak 5 ml diambil di vena cubiti, kemudian dibagi ke dalam dua tabung, tabung pertama berisi ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) dan tabung kedua tidak. Darah pada tabung EDTA akan digunakan untuk pemeriksaan ACTH plasma, sedangkan darah pada tabung tanpa EDTA akan digunakan untuk pemeriksaan profil lipid dan kadar 11-β hydroxylase serum.Plasma dan serum darah disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu -20°C dan stabil sampai 4 bulan.
b. Pemeriksaan kolesterol total
Pemeriksaankadar kolesterol total dilakukan dengan teknik kimiawi menggunakan reaksi enzimatis cholesterol oxidase - peroxidase/phenol/4-aminophenazone (metode CHOD-PAP). 1. Prinsip pemeriksaan:
Kolesterol ester dihidrolisis oleh kolesterol esterase yang menghasilkan kolesterol bebas.Kolesterol bebas selanjutnya
dioksidasi oleh kolesterol oksidase dan menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2). Selanjutnya, H2O2 diuraikan oleh peroksidase menghasilkan oksigen reaktif yang akan bereaksi dengan aminophenazone di bawah pengaruh phenol yang menghasilkan zat warna indikator quinoneimine yang dibaca oleh sfektrofotometer. Rekasi kimia yang terlibat dalam pemeriksaan adalah sebagai berikut:
a. Kolesterol ester + H2O ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ Kolseterol + Asam lemak b. Kolesterol + O2 ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ kolestene-3-one +H2O2 c. 2 H2O2 + 4-Aminophenazone + Fenol ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ quinoneimine
dye + 4 H2O
Quinoneimine dye dibaca dalam spektrofotometer. 2. Reagensia terdiri dari:
R1 4 x 100 ml reagen enzim
Phosphatebuffer (pH 6,5) 100 mmol/l 4-aminophenazone 0,25 mmol/l Phenol 5 mmol/l
Peroxidase > 5 KU/l Cholesterol esterase > 150 U/l Cholesterol oxidase > 100 U/l
Sodium azide 0,05% (as preservative) R2 3 ml standar
3. Persiapan reagen:
Reagen enzim dan standar terlah siap digunakan.Reagen stabil sampai batas kadaluarsa pada temperatur ruangan (2-8°C).
4. Spesimen:
Spesimen yang digunakan pada pemeriksaan kolesterol total ini adalah serum.
5. Prosedur pemeriksaan: Panjang gelombang: 500 nm Kuvet: 1 cm
Temperatur: 20-25°C
Pengukuran: dibandingkan dengan reagen blanko.
a. Larutan disiapkan dengan ketentuan seperti di bawah ini. Blanko Sampel/Standar Sampel/standar R1 - 1000 μl 10 μl 1000 μl
b. Larutan dicampur dan didiamkan 10 menit pada suhu 20-25°C. c. Mengukur nilai absorbansi dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 500 nm. Pengukuran absorbansi dimulai sampel dan standar dilakukan terhadap blanko.
d. Menghitung kadar kolesterol total serum dengan rumus berikut
c. Pemeriksaan kadar kolesterol HDL
Pengukuran kadar kolesterol HDL dilakukan dengan teknik presipitasi yang dilanjutkan dengan pemeriksaan human cholesterol liquicolor.
1. Prinsip pemeriksaan:
Pemeriksaan kolesterol HDL ini didahului dengan pemisahan kolesterol HDL menggunakan reagensia presipitasi.Kilomikron, very low density lipoprotein (VLDL), dan LDL dipresipitasi dengan menambahkan phosphotungesic acid dan magnesium klorida (MgCl2).Supernatan yang diperoleh setelah proses sentrifugasi mengandung HDL, kemudian diperiksa kadarnya dengan menggunakan human cholesterol liquicolor.
2. Reagensia yang digunakan adalah: Reagen presipitasi 4x80 ml presipitan
Phosphotungesic acid 0,55 mmol/l Magnesium klorida 25 mmol/l
Standar 1x3 ml standar
Kolesterol 50mg/dl (1,29 mmol/l) 3. Spesimen yang digunakan adalah serum.
4. Prosedur pemeriksaan: a. Presipitasi.
Pipet ke dalam tabung sentrifugasi Makro Semi-mikro Sampel Presipitan a Presipitan b 500 μl 1000 μl - 200 μl - 500 μl
b. Larutan dicampur dan didiamkan 10 menit pada suhu 20-25°C, kemudian disentrifugasi 2 menit pada 10.000 g. c. Supernatan dipisahkan dalam waktu 1 jam dan diperiksa
dengan menggunakan human cholesterol liquicolor. d. Larutan disiapkan dengan ketentuan sebagai berikut:.
Pipet ke dalam kuvet Blanko Standar Sampel Aqua destilata Standar Supernatan HDL HCl 100 μl - - 1000 μl - 100 μl - 1000 μl - - 100 μl 1000 μl
e. Larutan tersebut dicampur dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 20-25°C.
f. Mengukur nilai absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm dalam waktu 60 menit. Pengukuran absorbansi sampel dan standar dilakukan terhadap blanko.
d. Pemeriksaan kadar trigliserida
Pemeriksaankadar trigliserida dilakukan dengan teknik kimiawi menggunakan reaksi enzimatisglycerol phosphate oxidase - peroxidase/phenol/4-aminoantipyrine(metode GPO-PAP).
1. Prinsip pemeriksaan:
Trigliserida diuraikan oleh enzim lipase menjadi glisero dan asam lemak.Glycerol kinase mengkatalis glycerol + ATP menjadi glycerol 3-fosfat + ADP.Glycerol 3-fosfat kemudian dioksidase oleh glycerol phosphate oxidase dan menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2).H2O2 diuraikan oleh peroksidase menghasilkan oksigen reaktif yang bereaksi dengan aminoantipyrine (AAP) dibawah pengaruh fenol yang menghasilkan zat warna indikator quinoneimine yang dibaca dalam spektrofotometer.
Rekasi kimia yang terlibat dalam pemeriksaan trigliserida ini adalah sebagai berikut:
a. Trigliserida ⎯⎯⎯ gliserol + asam lemak
b. Gliserol + ATP ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ gliserol 3-fosfat + ADP
c. Gliserol 3-fosfat + O2 ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ Dihidroksiaseton fosfat + H2O2
d. 2 H2O2 + 4-AAP + 4-klorofenol ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ Quinoneimine + 4 H2O Kadar kolesterol HDL = 150 mg/dl
PIPES buffer (pH 75) 50 mmol/l
4-chlorophenol 5 mmol/l
4-aminophenazone 0,25 mmol/l
Magnesium ion 4,5 mmol/l
Adenosine Triphosphate 2 mmo/l
Lipase ≥ 1300 U/l
Peroxidase ≥500 U/l Glycerolkinase ≥400 U/l Glycerol 3-phosphate oxidase ≥ 1300 U/l
Sodium azide 0,05%
Standar: 3 ml standar
Trigliserida 200mg/dl (2,28 mmol/l) 3. Spesimen:
Spesimen yang digunakan adalah serum. 4. Prosedur pemeriksaan:
Panjang gelombang: 500 nm Kuvet: 1 cm
Temperatur: 20-25°C
Pengukuran: dibandingkan dengan reagen blanko.
Blanko Sampel/Standar Sampel/standar Reagen - 1000 μl 10 μl 1000 μl
b. Larutan dicampur dan didiamkan 10 menit pada suhu 20-25°C. c. Mengukur nilai absorbansi dengan mesin spektrofotometri pada
panjang gelombang 500 nm. Pengukuran absorbansi sampel dan standar dilakukan terhadap blanko.
d. Menghitung kadar trigliserida serum dengan rumus berikut.
e. Pemeriksaan kadar kolesterol LDL
Kadar kolesterol LDL dihitung berdasarkan kadar kolesterol total, kolesterol HDL dan trigliserida (TG) dengan menggunakan rumus Friedwald.
f. Pemeriksaan kadar ACTH plasma
PemeriksaankadarACTH plasma dilakukan dengan metode immunolite 1000 ACTH.
1. Prinsip pemeriksaan:
Immunolite 1000 ACTH merupakan solid-phase, two-site sequential chemiluminescent immunometric
Kadar Trigliserida = 200 [mg/dl]
teknik pemeriksaan laboratorium yang digunakan untuk mengukur kadar suatu substansi dengan menggunakan prinsip reaksi antigen-antibodi yang akan menghasilkan cahaya secara kimiawi. Emisi cahaya yang dihasilkan inilah yang akan dibaca oleh alat.
2. Reagensia yang digunakan terdiri dari:
a. ACTH unit test (LAC1): setiap unit terdiri dari satu bantalan yang dilapisi dengan antibodi monoklonal anti-ACTH.
b. Reagen ACTH A (LACA): 7,5 ml protein buffer/ serum matrix
c. Reagen ACTH B (LACB): 7,5 ml alkalin fosfat dari usus sapi terkonjugasi dengan antibodi poliklonal anti-ACTH kelinci dalam buffer, dengan pengawet.
d. ACTH adjustor (LACH): dua vial (rendah dan tinggi) lyophilized ACTH dalam protein sapi dengan pengawet. e. ACTH sample diluent (LACZ): untuk dilusi sampel
pasien secara manual. Setiap vial mengandung 25 ml ACTH-free bovine protein-based matrix dengan pengawet.
3. Persiapan dan stabilitas:
a. Seluruh komponen kit stabil samapi batas waktu kadaluarsa pada suhu 2-8°C.
b. ACTH adjustor, larutkan setial vial dengan 4 ml air terdestilasi. Larutan stabil selama 2 bulan pada suhu -20°C. c. ACTH sample diluent (LACZ), stabil selama 6 bulan pada
suhu -20°C.
4. Spesimen yang digunakan adalah plasma. Darah vena dimasukkan ke dalam tabung EDTA. Plasma dipisahkan dan disimpan pada suhu -20°C dan stabil dalam 4 bulan.
5. Prosedur kerja:
Prosedur persiapan, dilusi, adjustment, pemeriksaan, dan quality control dilakukan sesuai dengan manual operasional Immunolite 1000 ACTH.
g. Pemeriksaan kadar 11-β Hydroxylase serum
Pemeriksaan kadar11-β hydroxylase serum dilakukan dengan teknik quantitative sandwich enzyme immunoassay.
1. Prinsip pemeriksaan:
Sumur dalam microplate telah dilapisi dengan antibodi spesifik terhadap 11-β hydroxylase.Standar dan sampel dipipet ke dalam sumur dan sebagian 11-β hydroxylase yang ada diikat oleh antibodi.Setelah menghilangkan semua substans yang tidak berikatan, biotin-conjugated antibody yang spesifik untuk 11-β hydroxylase ditambahkan ke dalam sumur. Setelah pencucian, avidin conjugated horseradish peroxidase (HRP)
menghilangkan reagen avidin-enzyme yang tidak berikatan, suatu larutan tetramethylbenzidine (TMB)substrate ditambahkan ke dalam sumur dan terbentuklah warna yang dibaca pada microplate reader.Intensitas warna yang terbentuk proporsional dengan jumlah 11-β hydroxylase yang terikat pada tahap awal.
2. Reagensia yang digunakan terdiri dari Biotin-antibody (1x), horseradish peroxidase avidin (HRP-avidin) (1x), dan Wash Buffer (1x).
3. Spesimen yang digunakan pada pemeriksaan ini adalah serum. 4. Persiapan reagen, standar, dan sampel:
a. Biotin-antibody (1x)
Vial disentrifugasi sebelum dibuka. Biotin-antibody perlu diencerkan 100 kali, 10 μl biotin-antibody dicampurkan dengan 990 μl Biotin-antibody diluent.
b. Horseradish peroxidase avidin (HRP-avidin) (1x)
Vial disentrifugasi sebelum dibuka.HRP-avidinperlu diencerkan 100 kali, 10 μl HRP-avidindicampurkan dengan 990 μl HRP-avidin diluent.
c. Wash Buffer (1x)
Sebanyak 20 ml wash buffer concentrate (25x) diencerkan ke dalam air terdestilasi untuk menyiapkan 500 ml wash buffer (1x).
d. Standar
Vial yang berisi standar disentrifugasi pada 6000-10000 rpm selama 30 detik. Standar dilarutkan dengan 1 ml pelarut sampel.Larutan ini digunakan menjadi larutan stok dengan konsentrasi 1500 pg/ml (S7). Larutan stok ini kemudian diencerkan secara berseri dengan faktor pengenceran 2x dengan mengambil 250 μl larutan standar dan menambahkan 250 μl pelarut sampel (S6-S1). Pelarut sampel sebanyak 250 μl dimasukkan ke dalam tabung sebagai standar nol (0 pg/ml).
5. Prosedur pemeriksaan:
a. Seluruh reagen, standar, dan sampel diletakkan pada suhu ruangan.
b. Sebanyak 100μl standar dan sampel ditambahkan ke dalam tiap sumur microplate. Permukaan sumur ditutup dengan selotip yang disediakan pada kit kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C.
c. Cairan pada setiap sumur dipindahkan tanpa dicuci. d. Sebanyak 100μl biotin-antibody (1x) ditambahkan pada
setiap sumur. Permukaan sumur ditutup dengan selotip yang baru kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C.
e. Setiap sumur diaspirasi dan dicuci, prosedur tersebut diulang sebanyak 2 kali. Sumur dicuci dengan cara mengisi setiap sumur dengan wash buffer (200μl) menggunakan pipet dan biarkan selama 2 menit.
f. Sebanyak 100μl horseradish peroxidase avidin (HRP-avidin) (1x) ditambahkan ke dalam setiap sumur. Permukaan sumur ditutup dengan selotip yang baru dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C.
g. Aspirasi/ proses pencucian diulang sebanyak 5 kali pada tahap 6.
h. Sebanyak 90μl tetramethylbenzidine (TMB) substrate ditambahkan pada setiap sumur, kemudian diinkubasi selama 15-30 menit pada suhu 37°C. Sumur dilindungi dari cahaya.
i. Sebanyak 50μl stop solution ditambahkan pada setiap sumur, kemudian plate dihentakkan dengan perlahan untuk mencampur larutan.
j. Menentukan densitas optikal setiap sumur selama 5 menit dengan menggunakan microplate reader pada gelombang 450nm.
k. Menentukan kadar 11-β hydroxylase sampel ditentukan dengan menggunakan kurva standar yang dibuat dengan menggunakan program Curve Expert 1,3.
Prinsip penentuan kadar sampel dengan kurva standar: i. Letakkan nilai densitas optikal standar pada
sumbu X, dan nilai konsentrasi standar pada sumbu Y.
ii. Menghubungkan titik-titik yang berdekatan dan membentuk kurva standar. Tentukan kadar sampel dengan meletakkan nilai densitas pada sumbu X, menarik garis yang memotong kurva linear yang dibentuk oleh standar (kurva standar) kemudian mencari nilai konsentrasi pada sumbu Y.
Gambar 3.2 Contoh Kurva Standar11β-hydroxylase