METODE PENELITIAN
3.5 Cara Kerja Penelitian
3.5.1 Penyiapan Sampel atau Pembuatan Simplisia
Daun Garcinia benthami Pierre yang dipilih dalam penelitian ini yaitu daun segar dan tidak cacat dari strukturnya sebanyak 6 kg, kemudian dikeringkan di Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITRO) dengan cara oven sampai kering.
Setelah kering, simplisia dibersihkan dari kotoran-kotoran yang mungkin menempel pada permukaan maupun belakang daun. Selanjutnya simplisia dihaluskan dengan menggunakan blender sampai terlihat halus. Setelah itu, simplisia ditimbang sebanyak 1 kg untuk proses ekstraksi dan proses selanjutnya.
3.5.2 Pembuatan Ekstrak Daun Garcinia benthami Pierre
Sebanyak 1 kg dari daun Garcinia benthami Pierre dimasukkan ke dalam botol untuk dilakukan maserasi dengan pelarut n-heksan sebanyak 6 L yang sebelumnya telah di destilasi dengan rotary evaporator. Maserasi dilakukan sebanyak 3 hari. Hasil maserasi disaring dengan menggunakan kertas saring dan dari hasil penyaringan diperoleh filtrat. Kemudian filtrat tersebut dipekatkan menjadi ekstrak kental dengan memasukkan ke dalam labu
evaporator. Pelarut diuapkan menggunakan rotary evaporator pada suhu + 450C sampai pelarut tidak keluar lagi pada labu alas bulat tempat sisa penampungan pelarut, sehingga didapatkan ekstrak kental n-heksan. Hasil penyaringan juga didapatkan ampas simplisia dan kemudian kembali maserasi dengan pelarut n-heksan hingga didapatkan filtat n-heksan mendekati hijau bening agar klorofil yang terdapat pada daun dapat hilang semua. Telah dilakukan tujuh kali proses maserasi dan dilakukan dalam waktu + 1 bulan. Setiap dilakukannya proses maserasi tersebut, masing-masing ekstrak kental yang disatukan dan dipindahkan ke dalam cawan penguap. Setelah diproses maserasi telah selesai, maka hasil ekstrak kental yang telah didapatkan dikeringkan dalam oven sampai didapatkan ekstrak
n-heksan yang kering (konsentrasi 100 %) ditimbang.
3.5.3 Uji Aktivitas Toksisitas Dengan metode BSLT
Pengujian dilakukan pada ekstrak kental daun Garcinia benthami Pierre dengan metode BSLT. Metode BSLT merupakan metode skrining awal terhadap senyawa aktif yang terdapat pada tanaman yang akan diuji. Selain itu, proses pengerjaannya pun mudah, relatif tidak mahal, dan tidak membutuhkan waktu yang lama. Metode BSLT pun mempunyai tingkat kepercayaan sekitar 95% untuk uji toksisitas suatu senyawa di dalam ekstrak kasar tanaman.22
Sebelum melakukan pengujian, dilakukan penetasan larva Artemia salina
Leach terlebih dahulu dengan menetaskan telurnya 48 jam. Air laut yang digunakan untuk penelitian, pH nya diukur terlebih dahulu. Dari hasil pengukuran didapatkan pH air laut adalah pH 8-9. Penetasan dilakukan dengan cara merendam telur tersebut dalam air laut secukupnya pada wadah. Wadah tersebut dibagi menjadi dua bagian dengan menggunakan sterofoam dan diberi lubang di bagian bawahnya. Wadah yang telah dibagi menjadi dua bagian tersebut, sebagian diberi lakban pada samping wadah dan ditutupi aluminium foil diatasnya serta tidak dikenai sinar lampu dan yang sebagian lagi tidak dilakban dan tidak diberikan aluminium foil di atasnya dan diberi
sinar lampu. Perlakuan tersebut digunakan untuk meletakkan telur pada tempat yang tidak di terang/gelap sehingga telur dapat menetas dan berpindah ke lubang pada daerah yang tidak diberi sinar lampu.
Setelah didapatkan larva Artemia salina Leach, dilakukan penimbangan pada ekstrak n-heksan sebanyak 2000 mg. Kemudian dilakukan pengenceran dengan akuades, akan tetapi karena n-heksan merupakan pelarut non polar sehingga pada ekstraknya diberikan tambahan 2 ml larutan DMSO dalam labu 100 ml ditambahkan aquades sampai batas kalibrasi. Kemudian dilakukan pengenceran dengan membuat konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, 2500 ppm, 5000 ppm, 10.000 ppm, dan 15.000 ppm dari masing-masing dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali (triplikat). Kemudian dimasukkan 10 ekor larva Artemia salina Leach ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 9 ml air laut dan dicampurkan 1 ml larutan pengenceran dari masing-masing konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, 2500 ppm, 5000 ppm, 10.000 ppm, dan 15.000 ppm. Sehingga didapatkan konsentrasi ekstrak pada tabung reaksi terisi larva Artemia salina Leach yaitu 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, dan 1500 ppm, karena adanya penambahan dengan 9 ml air laut dan 1 ml ekstrak. Untuk memastikan efek DMSO terhadap larva Artemia salina Leach dilakukan uji BSLT hanya dengan menggunakan DMSO dengan cara memasukkan 2 ml DMSO di dalam labu 100 ml tanpa penambahan ekstrak ditambahkan aquades sampai batas kalibrasi labu tersebut. Kemudian dilakukan pengenceran dengan membuat konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm 1500 ppm, 2500 ppm, 5000 ppm, 10.000 ppm, 15.000 ppm, dan 20.000 ppm. 10 ekor larva Artemia salina Leach dimasukkkan ke dalam tabung reaksi kemudian diambil 9 ml air laut dan ditambahkan 1 ml dari pengenceran DMSO tersebut, sehingga konsentrasi DMSO pada masing-masing tabung reaksi yaitu yaitu 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, dan 2000 ppm. Selain itu, pembuatan kontrol negatif pada air laut juga telah dilakukan. Dimasukkan 10 ekor larva
Artemia salina Leach ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air laut tanpa penambahan ekstrak.
3.5.4 Pengukuran Toksisitas
Uji toksisitas yang dilakukan dengan metode BSLT menggunakan larva
Artemia salina Leach terhadap ekstrak n-heksan. Sehingga diperoleh suatu data yang kemudian diolah dengan menggunakan metode analisis probit untuk menentukan nilai LC50.
Pengukuran dilakukan dengan menghitung jumlah Artemia salina Leach yang mati sebanyak 50 % dari total larva uji (10 ekor pada tabung reaksi). Kemudian nilai LC50 dihitung dengan memasukkan angka probit (50% kematian larva uji). Efek toksisitas dihitung dari persen kematian larva
Artemia salina Leach.23
% kematian =
x 100 %
Kemudian membuat persamaan regresi linier:24
y = a+bx y = nilai probit,
x = log konsentrasi. a =Intercept (garis potong)
b = Slope (kemiringan dari garis regresi linear)
LC50 adalah nilai y yang dimasukkan ke dalam nilai x = 50%. Apabila pada kontrol ada larva yang mati, maka persen kematian ditentukan dengan rumus Abbot: 23
% kematian =
x 100 %
T = jumlah larva uji yang mati,
K = jumlah larva kontrol yang mati 10 = jumlah larva uji.
3.5.5 Analisis Data Toksisitas
Ada banyak cara untuk menentukan nilai LC50. Salah satu cara yaitu dengan metode probit. Cara ini dilakukan dengan menghitung frekuensi (% respon) efek yang ditimbulkan kemudian dihubungkan dengan dosis dalam skala logaritma, maka akan diperoleh kurva dengan bentuk sigmoid ( ʃ ). Bagian tengah kurva yaitu, antara 16-84 % respon cukup proporsional (lurus) untuk memperkirakan efek hubungan dosis versus respon, baik efek farmakologi (ED50) atau toksikologi (LC50). Sedangkan bagian yang tidak lurus, menunjukkan respon kematian kurang dari 16% atau lebih dari 84% dapat diluruskan dengan memprobitkan.7
Untuk menghitung LC50 berdasarkan metode probit, berikut merupakan langkah pembuatan perhitungan LC50, yaitu : 7
1. Mempunyai tabel probit
2. Menentukan nilai probit dari % kematian tiap kelompok hewan uji 3. Menentukan log dosis tiap-tiap kelompok
4. Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log dosis, y= ax+b
5. Masukkan nilai 5 (probit dari 50% kematian hewan coba) pada persamaan garis lurus, pada nilai y. Nilai LC50 dihitung dari nilai anti logX pada saat Y= 5.
Dari langkah-langkah yang telah disebutkan diatas, maka pada penelitian akan dibuat:
1. Data persentase kematian larva Artemia salina Leach dilihat pada tabel probit sehingga diperoleh nilai probit,
2. Kemudian membuat grafik antara log konsentrasi (x) dan nilai probit (y) sehingga diperoleh persamaan regresi linier y = a+bx. 3. Masukkan nilai y = 5 (probit dari 50%) pada persamaan y=a+bx,
maka nilai LC50 ditentukan dengan nilai x
4. Selanjutnya nilai X dikonversikan ke bentuk antilog. Ekstrak dikatakan bersifat toksik jika harga LC
50 < 1000 ppm, sedangkan untuk senyawa murni jika LC
50 <200 ppm berpotensi sebagai antikanker. 13
23
