BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.7 Cara Kerja Penelitian
i. Sterilisasi Alat dan Bahan
Seluruh alat yang digunakan dicuci bersih lalu dikeringkan dan dibungkus dengan kertas. Setelah itu, alat yang sudah dibungkus kertas disterilkan dengan menggunakan oven pada suhu 1500 C. Sedangkan semua tabung ditutup kapas (sebaiknya diisi terlebih dahulu cairan yang ingin digunakan) dan tip dibungkus plastik tahan panas lalu di autoklaf pada suhu 1200 C (1,5 atm).46
ii. Pembuatan media
1. Media padat NA (Nutrien Agar) Cara pembuatan:
Timbang serbuk NA lalu campur dengan aquades dalam beker glass. Masukkan stir magnet dan masak di atas hot plate pada suhu sedang 1500 C selama ± 20-25 menit, tunggu hingga warna berubah menjadi jernih. Angkat media NA dalam beker glass tuang ke tabung erlenmeyer,lalu tutup kapas dan siap untuk disterilisasi dalam autoklaf.46,53
2. Media cair NB (Nutrien Broth) Cara pembuatan:
Timbang serbuk NB lalu campur dengan aquades dalam beker glass. Masukkan stir magnet dan masak di atas hot plate pada suhu sedang 1500 C selama ± 20-25 menit tunggu hingga warna berubah menjadi jernih. Angkat media NB dalam beker glass tuang ke tabung erlenmeyer (untuk sampel) dan tabung reaksi (untuk seri pengenceran) lalu tutup kapas dan siap untuk disterilisasi dalam autoklaf.46,53
3. Media padat spesifik Escherichia coli EA (Endo Agar) Cara pembuatan:
Timbang serbuk EA lalu campur dengan aquades dalam beker glass. Masukkan stir magnet dan masak di atas hot plate pada suhu sedang 1500 C selama ± 20-25 menit tunggu hingga warna berubah menjadi jernih. Angkat media EA dalam beker glass tuang ke tabung erlenmeyer lalu tutup kapas dan siap untuk disterilisasi dalam autoklaf.46,53
4. Media padat spesifik Salmonella sp. dan Shigella sp. SSA (Salmonella Shigella Agar)
Cara pembuatan:
SSA mempunyai teknik khusus dalam membuat medianya, berbeda dengan media lainnya. Media SSA tidak dapat diikut sertakan saat sterilisasi di autoklaf karena media SSA akan rusak jika diautoklaf. Solusinya adalah aquades yang akan digunakan saja disterilisasi dalam autoklaf kemudian setelah aquades steril, campurkan dengan SSA dan masak diatas hot plate pada suhu sedang 1500 C selama ± 20-25 menit tunggu hingga warna berubah menjadi jernih.46,53
iii. Penuangan Media Padat (Agar)
Jika media sudah dibuat, maka saatnya menuangkannya ke dalam cawan petri. Prinsip proses penuangan media adalah sama untuk semua media, yaitu jika sudah diletakkan di dalam lemari es untuk penyimpanan awal, maka cairkan kembali media di atas hot plate lalu tuang ke dalam cawan petri dengan teknik khusus guna meminimalisir terkontaminasi. Oleh karena itu, penuangannya dilakukan dekat dengan bunsen dan selalu jaga kesterilan media yang sudah dibuat.46,52
Gambar 3.1 Tahapan pembuatan media kultur Sumber : Agnes Sri Harti, 2014
iv. Persiapan Sampel
Sampel disiapkan lalu diblender (kondisi blender steril). Setelah sampel halus, ambil 20 gr sampel diletakkan di atas alumininum foil.
3.7.2 Tahap Pengujian
i. Metode TPC (Total Plate Count) dan Isolasi Bakteri
Sampel yang sudah dipersiapkan sebanyak 20 gr dimasukkan ke dalam NB 180 ml (dalam tabung erlenmeyer) lalu aduk rata dengan vortex. Setelah tercampur rata (NB dan sampel), ambil 1 cc NB 180 ml dengan menggunakan mikropipet, lalu masukkan ke dalam tabung reaksi yang pertama (seri pengenceran). Lakukan hal yang sama hingga tabung reaksi ke enam.46
Selanjutnya, ambil 0,1 cc dari tabung reaksi ketiga (10-3) masukkan ke dalam cawan petri yang sudah terisi NA (2 cawan petri karena akan dilakukan duplo, maka cawan petri NA dikalikan 2). Lakukan hal yang serupa hingga tabung reaksi keenam dan masukkan ke dalam
masing-masing cawan petri NA yang berbeda. Selanjutnya spread atau ratakan dengan batang L.46 Ilustrasi tahapan TPC ini dapat dilihat pada gambar 3.2.
Setelah itu, untuk isolasi bakteri guna mengetahui identitas bakteri tersebut. Isolasi bakteri dilakukan di media spesifik EA dan SSA. Ambil 0,1 cc dari seri tabung pertama dan masukkan ke dalam media spesifik. Lalu ratakan dengan ose bulat.46 Ilustrasi cara melakukan isolasi pada media padat dapat dilihat pada gambar 3.3.
Jika semua sampel sudah rata di masing-masing media agar, lalu inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 370C. Lalu hitung koloni dengan colony counter. 46 (Hitung kebermaknaan koloni berdasarkan ketentuan Badan POM).
Gambar 3.2 Proses TPC
Gambar 3.3 Metode isolasi bakteri pada cawan petri Sumber : Buton’s Microbiology for the health sciences.
Eighth edition, 2007
ii. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram juga dapat dilakukan dari media spesifik (Endo Agar dan SSA) guna mengidentifikasi bakteri patogen yang terkandung. Tahapannya adalah:
Ambil dan tandai dengan spidol objek glass lalu fiksasi diatas bunsen, kemudian teteskan NaCl 0,9% secukupnya (biasanya 1 ose saja). Ambil koloni yang telah diinkubasi secara aseptis lalu sebarkan koloni atas objek glass hingga tipis dan keringkan. Lalu sediaan ini direkatkan di atas bunsen 2-3x. Tuangkan ungu kristal karbol/gentian violet biarkan selama 3-5 menit lalu cuci dengan aquades. Tuangkan lugol, biarkan 1 menit, lalu bilas dengan aquades. Teteskan etil alkohol 95% hingga tak ada warna ungu yang mengalir dari sediaan lagi lalu cuci dengan air. Warnai dengan safranin selama 45-60 detik, cuci dengan air dan keringkan dengan kertas saring. Teteskan 1 tetes minyak imersi lalu lihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 100.46
iii. Uji resistensi antibiotik
Ambil koloni dari media spesifik dengan ose bulat. Masukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi NaCl 0,9% lalu vortex untuk homogenisasi. Samakan kejernihannya NaCl 0,9% yang terkandung bakteri dalam tabung reaksi tersebut dengan standar kekeruhan McFarland 0,5 dengan menambahkan NaCl 0,9% hingga kejernihannya sama. Setelah jernih, ambil koloni dalam tabung reaksi berisi NaCl 0,9% tersebut dengan swab lalu oleskan swab tersebut ke dalam media padat MHA. Rendam antibiotik (Amoxicillin, Ciprofloksasin dan Gentamisin) yang berbentuk cakram kertas tersebut dalam media MHA. Inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 370C. Ukur diameter daya hambat yang terbentuk di sekitar cakram kertas (antibiotik) tersebut.46,53
Inkubasi 18-24 jam pada suhu 370C
