PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
DAFTAR LAMPIRAN
2.3 Enzim Topoisomerase
Enzim adalah molekul protein tak hidup yang dihasilkan oleh setiap sel hidup (eukariota dan prokariota). Dapat dikatakan semua reaksi kehidupan hanya bisa dimungkinkan oleh adanya enzim. Di dalam sel, protein enzim melangsungkan ribuan reaksi kimia yang membuat sel dapat hidup, mengekstrak energi dari lingkungan, mengubah sumber energi menjadi molekul yang bermanfaat, memperbaiki dan membangun diri sendiri, melakukan pembuangan hasil samping, dan melakukan replikasi diri (Suhartono 1989).
Salah satu aplikasi enzimologi dalam hubungannya dengan kesehatan adalah pengukuran aktivitas enzim di dalam plasma maupun jaringan pada orang-orang yang mengalami gangguan fisiologis. Apabila terlihat perubahan aktivitas secara nyata, kita dapat mencurigai adanya kelainan metabolisme di dalam jaringan (Suhartono 1989). Salah satu enzim yang merupakan indikator adanya gangguan fisiologis di dalam tubuh adalah enzim topoisomerase, dimana enzim ini banyak ditemukan dalam kelimpahan yang sangat tinggi pada sel kanker dibandingkan sel sehat/normal.
Topoisomerase adalah enzim yang mengatur perubahan topologi DNA yang dilakukan dengan cara meningkatkan atau menurunkan jumlah pilinan pada heliks ganda. Terdapat dua golongan topoisomerase, golongan I dan II yang berbeda pada fungsi dan mekanisme kegiatannya. Enzim golongan I (topo I EC 5.99.1.2) bekerja dengan melakukan pemutusan sementara (transient break) dari satu utas DNA dalam DNA dan membebaskan tekanan pilinan, mengubah nomor mata rantai dengan langkah satu. Enzim golongan II (topo II EC 5.99.1.3) bekerja dengan melakukan pemutusan sementara kedua utas dari satu molekular DNA yang tersedia pada bagian rangkap dua DNA melalui suatu celah, merubah nomor mata rantai dengan langkah ganda. Enzim-enzim ini penting sekali untuk proses genetik sel seperti replikasi DNA, transkripsi, rekombinasi, dan pemisahan kromosom pada saat mitosis.
Enzim DNA topoisomerase dapat dijadikan target untuk penemuan beberapa antibiotik dan antikanker. Mekanisme atau cara kerja obat tersebut adalah menghambat kerja dari DNA topoisomerase atau menginaktifkan enzim DNA topoisomerase dengan cara memutus atau membelah (merusak) sebelum DNA melakukan replikasi/memperbanyak diri (Brutlag 2000).
2.4 Inhibitor Topoisomerase
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh berbagai faktor lingkungan seperti pH, suhu, pelarut, kekuatan ion, dan adanya inhibitor atau aktivator. Secara kimia, suatu inhibitor tidak dapat dibedakan dari aktivator. Setelah mereka berinteraksi dengan enzim, barulah kita dapat melihat perbedaannya. Aktivator, berkaitan dengan enzim dan menyebabkan kenaikan kecepatan reaksi enzim, sedangkan inhibitor, berkaitan dengan enzim dan menyebabkan penurunan kecepatan reaksi enzim (Suhartono 1989).
Ikatan inhibitor atau aktivator dengan enzim dapat mengubah kemampuan enzim dalam mengikat substrat dan mengubah kemampuan daya katalisator enzim. Hal ini disebabkan karena enzim yang sudah berikatan dengan inhibitor mengalami perubahan fisik dan kimiawi sedemikian rupa, sehingga, aktivitas hayatinya pun menjadi berbeda (terhambat). Dengan menganalisis penghambatan kerja suatu enzim oleh senyawa inhibitor yang mempunyai struktur kimia dan fisik yang telah diketahui, seorang peneliti dapat memperoleh informasi mengenai
8
banyak hal yang berharga, misalnya spesifikasi enzim, sifat-sifat fisik, kimia, dan molekular sisi aktif enzim tersebut, serta mekanisme kerja enzim (Suhartono 1989).
Enzim topoisomerase banyak ditemukan dalam kelimpahan yang sangat tinggi pada sel kanker dibandingkan sel sehat/normal dan diduga enzim ini merupakan enzim yang mempercepat pertumbuhan sel kanker. Banyak penelitian yang dilakukan untuk mencari inhibitor topoisomerase sebagai salah satu alternatif target penemuan obat baru pada penyakit kanker. Dewasa ini banyak senyawa dari bahan alam yang diisolasi dan dijadikan bahan baku obat kanker karena memiliki efek samping yang tidak berbahaya. Salah satu contoh obat antikanker dan berfungsi sebagai inhibitor topoisomerase I yang berasal dari bahan alam adalah Kamptotekin. kamptotekin dihasilkan oleh tumbuhan Camptotheca acuminata dari Famili Nyssaceae. Gambar 2 menyajikan gambar struktur senyawa inhibitor topoisomerase I kamptotekin dan topotekan.
kamptotekin topotekan
Gambar 2. Struktur senyawa inhibitor topoisomerase I (Brutlag 2000). 2.5 Ekstraksi
Ekstraksi adalah suatu istilah yang digunakan untuk memisahkan suatu komponen atau zat dari suatu bahan dengan menggunakan pelarut. Teknik ekstraksi didasarkan pada kenyataan bahwa jika suatu zat dapat larut dalam dua lapisan (fase) yang tidak dapat bercampur, maka zat itu dapat dialihkan dari satu lapisan (fase) kelapisan (fase) lain dengan mengocoknya bersama-sama (Achmadi 1992). Tingkat kemudahan ekstraksi bahan kering ditentukan oleh ukuran partikel bahan. Bahan yang diekstrak sebaiknya berukuran seragam untuk
N N O OH O O OH N N N O O O OH
mempermudah kontak antara bahan dengan pelarut sehingga ekstraksi berlangsung dengan baik (Sudarmadji dan Suhardi 1996).
Ada berbagai macam jenis pelarut yang dapat digunakan untuk proses ekstraksi. Jenis dan mutu pelarut yang digunakan sangat menentukan keberhasilan proses ekstraksi. Pelarut yang digunakan harus mempunyai persyaratan antara lain harus dapat melarutkan zat yang diinginkan, mempunyai titik didih yang cukup rendah, murah, tidak toksik, dan tidak mudah terbakar.
Pertimbangan yang harus diperhatikan terkait dengan sifat pelarut antara lain pelarut polar akan melarutkan senyawa polar, demikian sebaliknya pelarut non polar akan melarutkan senyawa nonpolar. Pelarut organik akan cenderung melarutkan senyawa organik, pelarut air cenderung melarutkan senyawa anorganik dan garam dari asam maupun basa organik. Asam-asam organik dapat diekstraksi ke dalam larutan air dengan mengunakan basa (Achmadi 1992). Tabel 1 menunjukkan beberapa jenis pelarut dan sifat-sifat fisiknya.
Tabel 1 Beberapa pelarut dan sifat-sifat fisiknya
Pelarut Titik Didih (oC) Titik Beku (oC) Konstanta Dielektrik
Dietil eter 25 -116 4.3 Aseton 56 -95 20.7 Kloroform 61 -64 4.8 Metanol 65 -98 32.6 Etil asetat 77 -84 6 Etanol 78 -117 24.3 Heksana 68 -94 1.8 Air 100 0 80.2 Toluena 111 -95 2.4
Sumber: Nur dan Adijuwana 1989.
Teknik ekstraksi yang tepat tergantung pada tekstur dan kandungan air bahan yang diekstrak dan pada jenis senyawa yang akan diisolasi. Banyak cara untuk melakukan proses ekstraksi suatu bahan. Pada dasarnya proses untuk mendapatkan suatu ekstrak yang diinginkan adalah sesuai dengan sifat pelarut yang digunakan. Ekstraksi menggunakan prinsip like dissolves like artinya pelarut polar akan melarutkan senyawa polar dan pelarut non polar akan melarutkan senyawa non polar (Khopkar 1990). Like dissolves like berlaku untuk semua bahan yang akan diekstraksi. Cara umum ekstraksi jaringan tumbuhan segar dan
10
fraksinasi ke dalam golongan senyawa yang berlainan berdasarkan kepolaran dapat dilihat pada Gambar 3 (Harborne 1987).
Secara umum ekstraksi dilakukan secara berturut-turut mulai dengan pelarut non-polar (heksana) lalu dengan pelarut yang semi polar (etil asetat), kemudian dengan pelarut polar (metanol). Dengan demikian akan diperoleh ekstrak kasar yang mengandung berturut-turut senyawa non-polar, semi polar, dan senyawa polar (Hostetmann et al. 1997). Ekstraksi dengan pelarut non-polar ditujukan untuk penghilangan lemak sebelum diekstraksi dengan pelarut yang sesuai, sehingga diperoleh ekstrak yang bebas lemak (Harborne 1987).
Gambar 3. Cara umum ekstraksi jaringan tumbuhan segar dan fraksinasi ke dalam golongan yang berlainan berdasarkan kepolaran (Harborne 1987).
Daun atau bunga segar
dimaserasi 5 menit dalam
MeOH-H2O (4:1) (10 x vol, atau bobot), filtrasi
ampas filtrat diekstraksi dengan EtOAc (5x), filtrasi filtrat ekstrak netral (lemak,lilin) dipisahkan dengan KLT pada silika atau KGC ektrak CHCl3
ekstrak polar pertengahan (terpenoid, atau senyawa fenol) dipisahkan dengan KKt atau KLT pada silika
dikeringkan, diuapkan ampas Serat (terutama polisakarida) lapisan air-asam di uapkan sampai 1/10 vol, (40oC)
diasamkan dengan H2SO4 2M diekstraksi dengan CHCl3 (3x) - dibasakan sampai pH 10 dengan NH4OH - diekstraksi dengan CHCl3- MeOH (3:1, 2x) dan CHCl3 lapisan air-basa ektrak CHCl3 - MeOH dikeringkan, diuapkan diuapkan, diekstraksi dengan MeOH ektrak basa (kebanyakan alkaloid) dipisahkan dengan KLT pada silika atau
elektroforesis diuapkan
ektrak polar ekstrak MeOH
(alkaloid kuarterner dan N-oksida)
2.6 Pengujian Genotoksisitas dengan Seratia marcescens
Uji genotosisitas oleh Hayes (1997) dan Johnson et al. (1998) dalam Anita (2005) dikategorikan dalam tiga macam, yaitu mutasi gen, perubahan struktur kromosom, dan efek terhadap DNA. Dalam penelitian ini menggunakan metode mutasi gen yang diartikan sebagai kerusakan genetik/(genotoksisitas, mutagenisitas). Uji ini merupakan salah satu cara untuk menentukan apakah suatu senyawa tidak beracun dan berbahaya. Uji mutasi gen bisa menggunakan bakteri tertentu seperti Serratia marcescens, Vibrio luminescens, Salmonella typhimurium. Pada penelitan ini digunakan bakteri S. marcescens seperti disajikan pada Gambar 4.
Gambar 4. Serratia marcescens (Anonim 2007).
S. marcescens merupakan bakteri Gram negatif yang mempunyai ciri menghasilkan pigmen merah yang tidak terdifusi yang disebut prodigiosin. Prodigiosin berasal dari kata prodigious yang artinya mukjizat atau sesuatu yang mengagumkan. Pengujian genotoksisitas dilakukan untuk melihat apakah bahan aktif mampu menyebabkan perubahan gen (mutasi gen) yang ditunjukkan dengan perubahan pigmen prodigiosin pada bakteri S. marcescens. Apabila bahan aktif tidak menghambat produksi warna, maka bahan aktif tersebut tidak menyebabkan perubahan gen (mutasi gen) namun bila sebaliknya maka bahan aktif tersebut bersifat genotoksik.
3. METODE
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2006–Februari 2007, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Pengujian GC-MS dilakukan di Laboratorium Terpadu Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah.
3.2Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat dan bahan-bahan untuk ekstraksi, identifikasi fitokimia, uji aktivitas inhibitor topoisomerase I, uji genotoksisitas, fraksinasi ekstrak aktif daun katang-katang, dan identifikasi senyawa aktif.
3.2.1 Alat
Alat-alat yang digunakan untuk menyiapkan bahan baku adalah evaporator putar vakum (IKA), mixer (vortex), pelat kromatografi lapis tipis, sentrifuse, UV kabinet dengan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm, seperangkat alat uji fitokimia, seperangkat alat uji inhibitor topoisomerase I (seperangkat alat elektroforesis), seperangkat kromatografi kolom, dan alat GCMS merek Shimadzu (HP) tipe QP 2010 Japan.
3.2.2 Bahan
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah daun katang-katang yang dikoleksi di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan, THP, IPB. Daun berasal dari Pulau Pari, Kepulauan Seribu. Daun dipisahkan dari ranting dan akar yang masih segar tanpa membedakan daun tua maupun daun muda. Daun katang-katang yang disediakan di Laboratorium telah dikeringkan dengan cara diangin-anginkan dan dihancurkan dengan blender sehingga berbentuk bubuk halus. Bubuk daun katang-katang tersebut disimpan dalam keadaan kering.
Pada uji fitokimia digunakan bahan-bahan kimia seperti pereaksi Dragendroff, Mayer, Wagner, dan lain-lain. Pada uji inhibitor topoisomerase digunakan kit topoisomerase I drug screening dari TopoGen yang terdiri dari
enzim topoisomerase I, substrat DNA supercoiled ditambah buffer reaksi, dan kamptotekin sebagai kontrol inhibitor topoisomerase I..
Pada uji genotoksisitas digunakan Serratia marcescens sebagai bakteri target yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi, Sekolah Tinggi Ilmu Hayati, Institut Teknologi Bandung. Media yang digunakan untuk penyegaran dan pertumbuhan bakteri meliputi pepton, beef extract, dan NaCl. Proses fraksinasi menggunakan seperangkat bahan kromatografi lapis tipis dan seperangkat kromatografi kolom, seperti lempeng lapis tipis silika gel 60 F254, pelarut sebagai eluen, dan lain-lain.
3.3 Tahapan Penelitian
Metode penelitian yang dilakukan terdiri dari tujuh tahap, yaitu (1) ekstraksi bahan aktif dari daun katang-katang, (2) pencucian ekstrak kasar,
(3) uji fitokimia ekstrak bersih, (4) uji inhibitor topoisomerase I dari ekstrak bersih, (5) uji genotoksisitas ekstrak aktif terhadap Seratia marcescens, (6) fraksinasi ekstrak aktif dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, dan (7) identifikasi fraksi hasil kromatografi kolom. Skema penelitian keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 5.
14
Gambar 5. Skema alur proses penelitian. Keterangan : : input
: proses : output
: diagram alir proses ekstraksi (dapat dilihat pada Gambar 6)
Ekstraksi senyawa aktif
Uji inhibitor Topo I Uji fitokimia
ekstrak kasar (1,2,3,4,5) bersih
Uji genotoksisitas Fraksinasi ekstrak aktif
KLT
Kromatografi Kolom
Ekstrak aktif
Pencucian ekstrak kasar (1, 2, 3, 4, 5)
Ekstrak kasar (1,2,3,4,5) bersih Bubuk kering sampel daun katang-katang
Fraksi ekstrak aktif
Identifikasi Fraksi murni
Nama senyawa
GCMS Ekstrak kasar (1,2,3,4,5)
3.3.1 Ekstraksi bahan aktif daunkatang-katang
Proses ekstraksi bahan aktif dilakukan dengan lima jenis pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda yaitu heksana (bersifat non polar), kloroform (bersifat semi polar), etil asetat (bersifat semi polar), aseton (bersifat polar) dan metanol (bersifat polar). Proses ekstraksi dilakukan secara bertingkat dimulai dari pelarut heksana, kloroform, etil asetat, aseton dan metanol. Sebelum ekstraksi dilakukan, sampel daun katang-katang dibersihkan selanjutnya dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Sampel daun katang-katang yang telah kering diiris kecil-kecil kemudian dihaluskan dengan blender dan ditimbang (±150 g). Ke dalam sampel yang telah ditimbang ditambahkan pelarut heksana sampai terendam (±300 ml) dan dilakukan proses maserasi selama 24 jam.
Selama proses maserasi bagian atas wadah ditutup dengan foil aluminium untuk mencegah menguapnya kandungan senyawa volatil dalam bahan dan pelarut. Setelah 24 jam, ekstrak disaring dengan menggunakan kertas saring, filtrat yang dihasilkan diuapkan dengan evaporator putar vakum hingga pelarut heksana menguap dan diperoleh ekstrak 1. Residu yang dihasilkan selanjutnya dikeringkan dan ditambah pelarut kloroform sampai terendam (±300 ml) dan dilakukan proses maserasi selama 24 jam. Kemudian disaring kembali dan filtrat yang dihasilkan diuapkan hingga pelarut kloroform menguap dan diperoleh ekstrak 2. Residu yang dihasilkan selanjutnya dikeringkan dan ditambah pelarut etil asetat sampai terendam (±300 ml) dan dilakukan proses maserasi selama 24 jam. Kemudian disaring kembali dan filtrat yang dihasilkan diuapkan hingga pelarut etil asetat menguap dan diperoleh ekstrak 3. Residu yang dihasilkan selanjutnya dikeringkan dan ditambah pelarut aseton sampai terendam (±300 ml) dan dilakukan proses maserasi selama 24 jam. Kemudian disaring kembali dan filtrat yang dihasilkan diuapkan hingga pelarut aseton menguap dan diperoleh ekstrak 4. Residu yang dihasilkan selanjutnya dikeringkan dan ditambah pelarut metanol (±300 ml) dan dimaserasi selama 24 jam, kemudian disaring, diuapkan dan diperoleh ekstrak 5. Dari proses ekstraksi ini diperoleh ekstrak 1 (pelarut heksana), ekstrak 2 (pelarut koroform), ekstrak 3 (pelarut etil asetat), ekstrak 4 (pelarut aseton) dan ekstrak 5 (pelarut metanol). Diagram alir proses ekstraksi katang-katang dapat dilihat pada Gambar 6.
16
Gambar 6. Diagram alir proses ekstraksi daun katang-katang. penghancuran
Dimaserasi 24 jam dengan heksana
Ekstrak heksana
Residu
Filtrat 2
Ekstrak kloroform
Filtrat 3
Ekstrak etil asetat
Dievaporasi Dimaserasi 24 jam dengan kloroform
Penyaringan
Penyaringan Dievaporasi
Dievaporasi
Dimaserasi 24 jam dengan etil asetat Filtrat 1
Penyaringan
Residu Daun katang-katang kering
Residu Filtrat 4 Ekstrak aseton Residu Filtrat 5 Ekstrak metanol
Dimaserasi 24 jam dengan aseton
Penyaringan
Penyaringan Dievaporasi
Dievaporasi
Dimaserasi 24 jam dengan metanol Residu
Setelah mendapatkan ekstrak, dilakukan pengukuran rendemen. Contoh pengukuran rendemen disajikan pada Lampiran 2. Rendemen diperlukan untuk mengetahui dan membandingkan jumlah senyawa atau ekstrak yang dapat terambil oleh pelarut. Banyak ekstrak dihitung berdasarkan rumus:
3.3.2 Pencucian ekstrak kasar
Ekstrak dicuci untuk menghilangkan bahan-bahan pengotor yang terdapat dalam ekstrak kasar dan zat yang tidak larut dalam pelarut aslinya. Ekstrak kasar dicuci dengan merendam ekstrak dengan pelarut aslinya dilanjutkan dengan pengocokan agar tercampur semua dan disimpan dalam lemari es selama semalam. Filtrat dipisahkan dengan supernatan atau endapan yang terbentuk, selanjutnya filtrat dipekatkan dengan cara evaporasi. Proses ini dilanjutkan beberapa kali sampai tidak terjadi endapan.
3.3.3 Uji fitokimia
Analisis fitokimia merupakan uji untuk mengetahui keberadaan senyawa kimia spesifik seperti alkaloid, senyawa fenol (termasuk flavonoid), steroid, saponin, dan terpenoid. Uji fitokimia yang dilakukan berdasarkan pada reaksi yang menghasilkan warna atau endapan (Harborne 1987). Prinsip kerja reaksi terjadinya warna dan endapan dapat dilihat dalam Lampiran 3.
A) Alkaloid
Sebanyak 1 gram ekstrak kasar ditambah 10 ml heksana dan beberapa tetes amoniak. Fraksi heksana dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dragendorff, Mayer, dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih oleh pereaksi Mayer, endapan merah oleh pereaksi Dragendorff, dan endapan cokelat oleh pereaksi Wagner.
B) Flavonoid dan Fenolik Hidrokuinon
Sebanyak 1 gram ekstrak kasar ditambahkan metanol 30% sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditaruh ke dalam spot plate (papan uji) dan kemudian
Rendemen 100% sampel bobot ekstrak bobot (%)= x
18
ditambahkan NaOH 10% (b/v) atau H2SO4 pekat. Terbentuknya warna merah karena penambahan NaOH menunjukkan adanya senyawa fenolik hidrokuinon sedangkan warna merah yang terbentuk akibat penambahan H2SO4 pekat menunjukkan adanya flavonoid.
C) Saponin
Sebanyak 1 gram ekstrak kasar ditambah air secukupnya dan dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok. Timbulnya busa yang bertahan lebih dari 10 menit menunjukkan adanya saponin.
D) Tanin
Sebanyak 1 gram ekstrak kasar ditambahkan air kemudian didihkan selama beberapa menit, lalu disaring. Filtratnya ditambahkan FeCl3 (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin.
E) Triterpenoid dan Steroid
Sebanyak 1 gram ekstrak kasar ditambahkan 25 ml etanol 30% lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambah eter. Lapisan eter dipipet dan diujikan pada papan uji dengan menambahkan pereaksi Liebermen Buchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid.
3.3.4 Uji aktivitas inhibitor topoisomerase I (TopoGen 2006)
Uji inhibitor enzim DNA topoisomerase I dilakukan menggunakan kit Drug Screening dari TopoGen dengan metode elektroforesis. Substrat yang digunakan adalah DNA supercoil 25 μg dalam 100 μl buffer TE, yang terdiri atas 0.25 μg/μl TE (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA) sebanyak 1 μl, kemudian ditambah 2 μl enzim DNA topoisomerase I. Volume reaksi akhir menjadi 20 μl. Penambahan dilakukan berurutan, yang terakhir ditambahkan adalah enzim topoisomerase I. Akuades ditambahkan untuk mencapai volume 20 μl. Selain untuk preparasi reaksi untuk sampel juga disertakan dengan reaksi-reaksi yang berfungsi sebagai kontrol (Lampiran 4). Gambar 7 menyajikan diagram alir uji aktivitas inhibitor topoisomerase I.
Gambar 7. Diagram alir uji aktivitas inhibitor topoisomerase I
Pereaksi harus dibuat dalam tabung mikrosentrifuse dalam es. Setelah penambahan enzim, tabung diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit, reaksi dihentikan dengan 1/10 volume dari 10% SDS. Selanjutnya ditambahkan dengan proteinase-K atau pronase (untuk menghancurkan ikatan protein) dan diinkubasi kembali pada suhu 37 oC selama 30 menit. Hasil inkubasi diencerkan dengan larutan penyangga kemudian diekstraksi dengan CIA (chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1) dan dilanjutkan sentrifugasi. Lapisan atas dari hasil sentrifugasi yang berwarna biru dianalisis elektroforesis dengan gel agarosa. Gel agarosa yang telah dielektroforesis selanjutnya diwarnai dengan etidiumbromida.
Kualitatif bentuk DNA nick dan supercoil ditentukan dengan melihat hasil gel agarosa yang telah dielektroforesis di bawah sinar UV. Aktivitas inhibisi enzim ditentukan dengan kemampuan enzim untuk mengubah bentuk DNA supercoil menjadi DNA bentuk nick atau relaks untuk topoisomerase I. Enzim DNA topoisomerase I yang digunakan adalah human topoisomerase I dari
Diinkubasi 37 oC selama 30 menit dalam heating block
Akuades untuk mencapai volume 20 µl 10 x buffer TGS 2 µl
DNA Supercoil (250 ng/µl) 1 µl
Inhibitor atau sampel Enzim DNA topoisomerase I 2 μl (terakhir)
Reaksi dihentikan dengan menambahkan 10% SDS (2 µl) dan proteinase-K 50 µg/ml diinkubasi pada 37 oC selama 30 menit
Hasil inkubasi diencerkan dengan loading buffer dan ditambahkan volume yang sama dengan 20 µl CIA
(chloroform : isoamyl alcohol 24:1)
Divorteks dan diputar dalam microfuge secukupnya
Lapisan teratas diambil (berwarna biru), lalu dielektroforesis dengan gel agarose 1% dan pewarnaan dengan ethidium bromide
20
TopoGen. Sebagai kontrol positif digunakan kamptotekin pada konsentrasi 100 µM (34.84 µg/ml).
3.3.5 Uji genotoksisitas dengan bakteri Seratia marcescens
Tahap awal melakukan uji genotoksisitas adalah proses penyegaran bakteri S. marcescens dalam agar miring. Media yang digunakan adalah pepton, beef extract, NaCl, bacto agar, dan akuades pH 7 (Lampiran 5), sedangkan untuk pengujian genotoksisitasnya menggunakan cawan petri.
Perlakuan yang digunakan adalah kontrol (tanpa ekstrak) dan ekstrak berturut-turut dengan konsentrasi 20, 200, 2 000, 20 000, 30 000, 40 000, dan 50 000 µg/ml. Proses pengujian genotoksisitas dimulai dengan persiapan media steril bervolume 15 ml. Setelah tersedia media steril maka dilakukan penambahan ekstrak pada berbagai konsentrasi yang telah ditentukan. Proses penambahan ekstrak dilakukan dengan kondisi agar yang tidak terlalu panas untuk menghindari kerusakan senyawa aktif pada ekstrak, selanjutnya campuran dituang ke dalam cawan petri. Media yang telah berisi ekstrak dalam petri didinginkan dan tidak boleh ada uap air dalam cawan petri. Setelah itu S. marcescens digores di atas agar dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu ruang. Alur proses pengujian genotoksisitas ekstrak kloroform daun katang-katang terhadap S. marcescens dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8. Uji genotoksisitas ekstrak koloroform daun katang-katang terhadap S. marcescens.
Ekstrak kloroform dengan konsentrasi 20, 200, 2 000, 20 000, 30 000, 40 000 dan 50 000 µg/ml dimasukkan dalam 15 ml
media Dihomogenkan
Pendinginan agar + ekstrak
S. marcescens digores di atas agar
Diinkubasi selama 24 jam suhu ruang Pengamatan hasil goresan
Setelah diinkubasi 24 jam dilakukan pengamatan secara visual dengan melihat hasil goresan yang terbentuk. Apabila hasil goresan berwarna putih maka ekstrak tersebut bersifat genotoksik, namun apabila tetap terbentuk warna merah sebagaimana warna bakteri S. marcescens maka ekstrak tidak bersifat genotoksik atau aman untuk digunakan sebagai bahan obat.
3.3.6 Fraksinasi dan isolasi senyawa inhibitor topoisomerase I 3.3.6.1 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Pemisahan senyawa inhibitor topoisomerase I dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan mencari eluen yang cocok untuk pemisahan komponen aktif dari ekstrak kloroform daun katang-katang. Eluen yang terbaik dalam kromatografi lapis tipis akan digunakan dalam proses kromatografi kolom.
Proses awal KLT adalah persiapan lempeng lapis tipis silika gel 60 F254 dengan ukuran panjang 10 cm dan lebar 2 cm, diberi tanda garis dengan pensil pada jarak 1 cm pada kedua ujung lempeng. Ekstrak katang-katang ditimbang sebanyak 0.02 g dan dilarutkan dalam 0.5 ml pelarut asalnya. Eluen yang akan digunakan dimasukkan ke dalam tabung kromatografi hingga tingginya sekitar 1 cm dari dasar tabung dan ditutup rapat agar jenuh dengan uap eluen. Larutan ekstrak sampel diteteskan dengan pipa kapiler pada lempeng silika gel. Penetesan dilakukan pada jarak 1 cm dari salah satu ujung tersebut. Ujung lempeng yang terdekat pada tempat penetesan dicelupkan ke dalam tabung kromatografi yang sudah jenuh dengan eluen. Tabung kemudian ditutup rapat dan dibiarkan pelarut naik sampai batas yang ditentukan (1 cm dari batas atas) (Gambar 9).
Gambar 9. Teknik kromatografi lapis tipis.
Batas atas
22
Setelah elusi pada batas tertentu, lempeng diangkat dan selanjutnya dikering udarakan selama beberapa menit, kemudian dideteksi dengan sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254 dan 365 nm.
Pemilihan pelarut (eluen) pada proses KLT dilakukan dengan kombinasi pelarut yang berbeda yaitu sistem B yang terdiri dari pelarut toluen : etil asetat (7 : 3). Terpilihnya sistem B dengan perbandingan tersebut didasarkan atas