DAFTAR ISI Halaman

DAFTAR TABEL ... DAFTAR GAMBAR ... DAFTAR LAMPIRAN ... PENDAHULUAN ... Latar Belakang ... Tujuan ... Manfaat Penelitian ... TINJAUAN PUSTAKA ...

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ... Klasifikasi ... Biologi dan ekologi . ... Kisaran inang ... Gejala ... Dampak ekonomi ... Sebaran geografi ... Deteksi dan Identifikasi Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis ...

Deteksi dan identifikasi Cmm berdasarkan morfologi dan fisiologi ... Identifikasi berdasarkan uji Biolog ... Identifikasi berdasarkan uji DAS-ELISA ... Identifikasi berdasarkan uji PCR... BAHAN DAN METODE ...

Tempat dan Waktu Penelitian ... Isolasi dan Identifikasi Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis dari Tanaman Tomat Bergejala ... Isolasi Cmm dari tanaman tomat bergejala ... Identifikasi Cmm berdasarkan uji Biolog ... Identifikasi Cmm berdasarkan uji ELISA ... Identifikasi Cmm berdasarkan uji PCR ...

xii xiii xiv 1 1 2 3 4 4 4 4 5 6 7 7 8 8 8 9 9 11 11 11 11 11 12 12 x

12 Perbandingan Metode Ekstraksi DNA dan Kondisi PCR ...

Perbandingan metode ekstraksi DNA Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ... Perbandingan kondisi PCR ... Uji Beberapa Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis pada Benih Tomat dengan Inokulasi Buatan ... Inokulasi buatan (Artificial inoculation) ... Ekstraksi Cmm pada benih tomat ... Deteksi Cmm dengan metode ELISA ... Deteksi Cmm dengan metode PCR ... Deteksi Cmm pada Beberapa Varietas Benih Tomat yang Dijual Bebas di Pasaran ... HASIL DAN PEMBAHASAN ... Isolasi dan Identifikasi Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis dari Tanaman Tomat Bergejala ... Identifikasi Cmm berdasarkan uji Biolog ... Identifikasi Cmm dengan uji ELISA ... Identifikasi Cmm dengan uji PCR ... Perbandingan Metode Ekstraksi DNA dan Kondisi PCR ...

Perbandingan metode ekstraksi DNA Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis ..... Perbandingan kondisi PCR ... Uji Beberapa Metode Deteksi Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis pada Benih Tomat dengan Inokulasi Buatan ... Deteksi Cmm dengan metode ELISA ... Deteksi Cmm dengan metode PCR ... Deteksi Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada Beberapa Varietas Benih Tomat yang Dijual Bebas di Pasaran ...

Deteksi Cmm dengan metode ELISA ... Deteksi Cmm dengan metode PCR ... KESIMPULAN DAN SARAN ... DAFTAR PUSTAKA ... 13 13 14 14 14 14 15 16 16 17 17 18 19 19 20 20 21 22 22 25 27 27 28 30 31 xi

DAFTAR TABEL

Halaman 1 2 3 4 5 6 7

Jenis sampel benih tomat yang diuji ... Hasil isolasi bakteri yang diduga Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis, hasil konfirmasi pada medium YDC dan identifikasi dengan uji Biolog ...... Hasil uji ELISA terhadap dua koloni bakteri yang diduga

Cmm ...

Hasil pengukuran konsentrasi DNA yang diperoleh dengan empat metode ekstraksi DNA ... Hasil uji DAS-ELISA terhadap benih tomat yang diinokulasi secara buatan ... Jumlah koloni Cmm yang tumbuh pada media SCM pada pengamatan hari ke-9 setelah plating ... Hasil pengujian DAS-ELISA terhadap beberapa varietas benih tomat.

16 19 19 21 23 24 27 xii

14

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gejala penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat ... Koloni Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis pada media SCM dan media YDC ... Hasil PCR Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis .... Hasil PCR pada DNA hasil empat metode ekstraksi DNA ........ Hasil PCR pada dua kondisi PCR ....... Hasil uji ELISA pada benih tomat dengan lama inkubasi 3 jam, 6 jam, 12 jam, dan 24 jam ... Hasil PCR terhadap templat hasil ekstraksi Cmm pada media cair yang diinkubasikan selama 3 jam, 6 jam, 12 jam, dan 24 jam ... Contoh beberapa kemasan benih tomat yang beredar di Indonesia . Hasil uji ELISA pada beberapa varietas benih tomat ... Hasil PCR pada beberapa varietas benih tomat ...

17 18 20 21 22 24 25 27 28 28 xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 2

3

Hasil pembacaan Biolog MicroStation Reader ... Komposisi media untuk isolasi dan deteksi Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis ...... Komposisi larutan bufer yang digunakan dalam penelitian ...

34

35 37

Latar Belakang

Tomat (Lycopersicum esculentum L.) merupakan salah satu komoditas hortikultura yang terus dikembangkan karena mempunyai nilai ekonomi cukup tinggi dan potensi ekspor yang besar. Namun demikian, banyak kendala yang dihadapi dalam upaya mendukung pengembangan, peningkatan produksi dan mutu produk untuk memenuhi kebutuhan nasional dan ekspor komoditas tomat, di antaranya adalah gangguan hama dan penyakit yang belum dapat diatasi dengan efektif. Salah satu penyakit penting yang menyebabkan penurunan produksi tomat adalah penyakit kanker bakteri yang disebabkan oleh Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (selanjutnya disebut Cmm).

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis adalah penyebab penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat dan tersebar luas di dunia. Penyakit ini dapat menyebabkan kerugian ekonomi hingga 60% dari produksi tomat di seluruh dunia (Strider 1969 dalam Dreier et al. 1997). Menurut Sahin et al.

(2002), kejadian penyakit kanker bakteri di Turki pada tahun 2001 mendekati 100% dan mengakibatkan kerugian besar pada pertanaman tomat. Produksi bibit tomat di rumah kaca yang terserang penyakit ini mengakibatkan kerugian sebesar 300 ribu dolar AS per tahun di Michigan (Hausbeck et al. 2000).

Selain menyerang tanaman tomat, patogen ini juga dilaporkan menginfeksi tanaman cabe di lapangan. Menurut Thompson (1986) dalam Dreier et al.

(1997), menyatakan bahwa tidak ada kultivar tomat yang resisten terhadap penyakit kanker bakteri ini dan belum ada pengendalian secara kimia yang efektif. Patogen yang terbawa dalam benih tomat merupakan sumber inokulum yang sangat penting bagi bakteri ini (Fatmi and Schaad 1995). Penularan penyakit kanker bakteri melalui benih dilaporkan antara 0.25% hingga 100% (Fatmi and Schaad 1995, CAB International 2007).

Cmm merupakan patogen tanaman yang termasuk dalam daftar patogen karantina di negara-negara Eropa bahkan di dunia internasional (European Union (1995) dalam Jahr et al. (2000), Kahn (1982) dan Franken et al. (1993)

dalam Dreier et al. 1997). Berdasarkan surat keputusan Menteri Pertanian No.38/Kpts/HK.060/1/2006 tanggal 27 Januari 2006, tentang Jenis-jenis Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina (OPTK) Golongan I Kategori A1 dan A2, Golongan II Kategori A1 dan A2, Tanaman Inang, Media Pembawa dan Daerah Sebarnya, Cmm merupakan salah satu jenis OPTK kategori A1 (OPTK

2 yang belum ada di Indonesia) yang harus dicegah penularannya ke dalam wilayah Indonesia. Ketergantungan Indonesia terhadap benih tomat impor dan importasi benih-benih tanaman lainnya memberikan tantangan bagi Badan Karantina Pertanian dalam melakukan deteksi terhadap kemungkinan masuknya

Cmm ke dalam wilayah Indonesia melalui benih impor.

Hasil penelitian Anwar (2004) menunjukkan bahwa bakteri Cmm sudah masuk ke Indonesia melalui benih tomat impor. Bakteri Cmm berhasil diisolasi dari benih tomat komersial yang tidak menunjukkan gejala. Berdasarkan laporan Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian (BBUSKP) tahun 2006, 2007, dan 2008, Cmm telah terdeteksi pada tanaman tomat bergejala yang merupakan sampel pemantauan dari Unit Pelaksana Teknis (UPT) Teluk Bayur Sumatera Barat dengan uji ELISA. CAB International (2007), menyebutkan bahwa bakteri penyebab kanker pada tomat ini juga telah ditemukan di Indonesia yaitu di Jawa dan masuk pada tahun 2002. Akan tetapi sampai saat ini belum banyak data yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut telah ditemukan di Indonesia dan sejauh mana penyebarannya. Sebagai OPT baru yang mempunyai potensi menyerang, menetap dan/atau menyebar ke kawasan tertentu, maka perlu dilakukan tindakan karantina untuk mencegah penyebaran yang lebih luas. Dalam rangka mencegah penyebaran Cmm yang lebih luas, maka diperlukan teknik deteksi patogen yang mudah, cepat dan akurat.

Metode pengujian kesehatan benih banyak dikembangkan seperti penggunaan medium semi selektif, uji morfologi, dan uji fisiologi. Metode ini memerlukan waktu yang cukup lama, dan tidak cukup sensitif karena banyaknya antagonis dari flora saprofitik. Metode deteksi yang banyak dikembangkan dan saat ini dilaporkan cukup sensitif dan cepat untuk deteksi patogen tanaman termasuk bakteri patogen yang terbawa benih adalah metode Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dan Polymerase Chain Reaction (PCR).

Berdasarkan hal tersebut di atas maka perlu dilakukan penelitian tentang pengembangan metode deteksi bakteri Clavibacter michiganensis subsp.

michiganensis untuk memperoleh metode deteksi yang relatif cepat dan akurat sehingga dapat digunakan sebagai metode pengujian kesehatan benih dalam rangka tindakan karantina.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan dan memperoleh teknik deteksi Cmm pada benih tomat yang mudah, cepat dan akurat. Penelitian juga

dilakukan untuk melihat metode ekstraksi dan lama inkubasi ekstrak yang paling sesuai untuk mendeteksi Cmm pada benih tomat.

Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai teknik deteksi

Cmm pada benih tomat yang mudah, cepat dan akurat dalam rangka tindakan karantina

TINJAUAN PUSTAKA

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

Klasifikasi

Klasifikasi bakteri penyebab kanker pada tomat berdasarkan Agrios (2005); adalah sebagai berikut : Clavibacter termasuk ke dalam kingdom Procaryotae, division Firmicutes, kelas Thallobacteria, genus Clavibacter.

Clavibacter mempunyai enam spesies yaitu C. iranicum, C. michiganensis, C. rathayi, C. tritici, C. toxicus, dan C. xyli (Schaad et al. 2001) . Spesies

Clavibacter michiganensis terdiri atas lima subspesies yaitu C. m. subsp.

insidiosus (Cmi), C. m. subsp. michiganensis (Cmm), C. m. subsp. nebraskensis (Cmn), C. m. subsp. sepedonicus (Cms), dan C. m. subsp. tessellarius (Cmt)

(Louws et al. (1998), Pastrik and Rainey (1999), Schaad et al. (2001), Gartemann et al. (2003), Burokiene et al. 2005). Clavibacter michiganensis

sebelumnya sering disebut dengan nama Corynebacterium michiganense.

Biologi dan ekologi

Penyakit kanker bakteri dapat ditularkan melalui benih dan mampu bertahan dalam periode waktu yang lama pada benih tomat (Chang et al. 1992). Berdasarkan Fatmi and Schaad (1995) dan CAB International (2007), penularan penyakit kanker bakteri melalui benih antara 0.25% hingga 100%.

Kejadian penyakit pada tanaman tomat di lahan produksi yang berasal dari benih terinfeksi relatif rendah. Meskipun demikian, benih terinfeksi adalah sumber inokulum utama di lahan produksi. Inokulum dari sedikit tanaman sakit yang tumbuh dari benih terinfeksi dapat menghasilkan infeksi sekunder yang tinggi akibat kegiatan seperti pemangkasan, pengikatan, dan pemanenan (Chang

et al. 1992).

Selain ditularkan melalui benih, penyakit ini juga dapat bertahan pada sisa tanaman tomat, inang alternatif, di dalam tanah, dan menyebar ke tanaman melalui percikan air hujan, aplikasi pestisida, dan air irigasi sehingga Cmm

tumbuh pada permukaan daun (Chang et al. 1992). Penyakit ini juga dapat menyebar ke bibit dan tanaman yang lain melalui kegiatan seperti pemangkasan dan pengemasan bibit tanaman, pengikatan dan pemasangan ajir tanaman tomat, membuang daun tua berpenyakit dan rusak, mengurangi tunas dan pengikatan tanaman di rumah kaca, dan umumnya melalui percikan air hujan, irigasi, atau penyemprotan bahan kimia. Infeksi pembuluh disebabkan oleh pekerjaan

manual dan dapat menyebabkan tanaman menjadi kerdil, layu, dan kematian pada tahap awal pertumbuhan (CAB International, 2007).

Cmm dapat menyebar dari tanaman dengan infeksi primer ke tanaman sekitarnya melalui percikan air, berpindahnya mesin pertanian, atau melalui pekerja saat kondisi lahan basah, nekrosis pinggir daun dan buah (Ricker and Riedel (1993) dalam CAB International 2007). Bakteri ini juga dapat bertahan sebagai epifit pada permukaan daun tomat. Patogen ini menyebabkan layu pada daun dan mengurangi produksi tanaman (Tsiantos (1987) dan Gleason et al.

(1991) dalam CAB International 2007, Chang et al. 1992).

Populasi bakteri Cmm menurun dengan cepat ketika sisa tanaman membusuk di tanah, tetapi bakteri ini dapat bertahan cukup lama pada sisa tanaman di permukaan tanah dan dapat menimbulkan penyakit pada musim tanam berikutnya (Gleason et al. 1991 dalam CAB International 2007, Chang et al. 1992. Cmm juga dapat bertahan pada tanaman tomat yang tersisa setelah panen dan pada inang alternatif (Strider 1969 dalam CAB International 2007).

Menurut van Vaerenbergh and Chauveau (1985), tanaman muda lebih rentan terhadap bakteri kanker. Lama waktu inkubasi bervariasi tergantung pada umur tanaman, tingkat resistensi, temperatur, dan konsentrasi inokulum.

Cmm terdapat pada jaringan xylem (Leyns and De Cleene 1983 dalam

CAB International 2007) yang menyebabkan rongga kosong karena lisis.

Patogen menghasilkan bahan beracun glikopeptida yang mempunyai aktifitas biologi (Miura et al. 1986 dalam CAB International 2007). Menurut Ueno et al.

(1994) dalam CAB International (2007) bahwa Cmm menghasilkan suatu toksin dan polisakarida yang tahan panas. Suatu polisakarida dengan berat molekul yang tinggi yang dihasilkan bakteri secara in vitro ditemukan sama dengan yang dihasilkan oleh tanaman dan diperkirakan berasosiasi dengan gejala layu yang dihasilkan pada tanaman tomat (Bulk et al. 1991 dalam CAB International 2007).

Kisaran inang

Menurut CAB International (2007), Inang utama Cmm adalah tomat

(Lycopersicon esculentum), sedangkan inang sekundernya adalah paprika

(Capsicum annuum)dan tumbuhan liar black nightshade (Solanum nigrum).

Gejala

Benih tomat dan tanaman di pembibitan di rumah kaca dengan infeksi berat kadang-kadang tidak menunjukkan gejala dan terlihat normal. Gejala pertama di lapangan adalah mengeringnya bagian pinggir daun, kemudian

6 secara perlahan mengering dengan atau tanpa terlihat layu. Tanaman muda yang terinfeksi menjadi kerdil dan layu dengan cepat. Pada infeksi stadium awal, bakteri Cmm mengkoloni pada pembuluh xylem, kemudian berlanjut ke pembuluh phloem, inti sel, dan kortex. Gejala pada bagian atas tanaman, baru terlihat pada stadium akhir. Gejala layu pada tanaman merupakan akibat dari tersumbatnya pembuluh xylem oleh koloni Cmm dalam konsentrasi tinggi dan adanya produksi exopolysaccharides (EPS) dengan berat molekul yang tinggi (Bermpohl et al. dan Meletzus et al. 1993 dalam Jahr et al. 2000).

Penyakit kanker bakteri pada tanaman tomat memperlihatkan gejala seperti bintik pada daun, batang, dan buah, serta mengakibatkan kelayuan pada daun dan tunas. Pada kondisi penyakit yang parah, akhirnya seluruh tanaman menjadi layu dan roboh. Kanker yang sangat kecil dapat terjadi pada batang dan tulang daun (Agrios 2005).

Daun bagian bawah seringkali berwarna putih, lepuh seperti bintik-bintik pada pinggiran daun, menjadi coklat seiring bertambahnya umur tanaman dan akhirnya bintik-bintik tersebut menyatu. Daun layu, menggulung ke atas dan ke dalam, kemudian berubah menjadi coklat dan layu tetapi daun tidak rontok. Layu dapat berkembang secara berangsur-angsur dari satu daun ke daun berikutnya sampai seluruh daun menjadi hancur. Pada batang, tunas, dan tangkai daun terlihat adanya garis berwarna terang, biasanya diantara lipatan petiol dan batang. Terakhir, garis tersebut berkembang menjadi retak dan terbentuk kanker. Pada kondisi yang lembab atau basah massa bakteri melalui permukaan batang yang retak menyebar ke daun dan buah dan menyebabkan infeksi sekunder. Buah yang berkembang menjadi kecil, dengan bintik putih pada bagian tengah yang akhirnya berubah menjadi coklat dan kasar. Kemudian bintik tersebut berubah menjadi bintik yang menyerupai mata burung (bird’s eye spot), dengan warna kecoklatan pada bagian tengah dan halo putih yang merupakan karakteristik dari penyakit ini. Pada batang yang terinfeksi, bagian longitudinal jaringan pembuluh berwarna coklat dengan rongga besar timbul dalam inti dan korteks sampai permukaan luar batang, dan membentuk kanker (Agrios 2005, Fahy and Persley 1983).

Infeksi lanjut ditunjukkan dengan gejala perubahan warna pada pembuluh berbentuk garis-garis coklat pada batang dan petiole. Pada potongan batang, petiole dan tangkai terutama pada bagian sambungan terjadi perubahan warna putih krem, kuning, atau coklat kemerahan dari jaringan pembuluh dan jaringan

gabus. Rongga pada jaringan gabus akan terlihat, dan pada kondisi tertentu, garis-garis berwarna coklat pada batang menjadi gelap dan terbuka menjadi kanker (CAB International 2007, Moffet et al. 1983).

Menurut Werner et al. (2002), gejala tanaman yang terinfeksi Cmm adalah terjadinya kelayuan, tanaman menjadi kerdil, terjadi penurunan hasil, dan matinya tanaman. Gejala pada daun yaitu terjadinya nekrosis yang di kelilingi klorosis, luka pada buah berupa bintik berwarna putih yang berkembang menjadi nekrotik.

Dampak ekonomi

Penyakit kanker bakteri pertama kali dilaporkan di USA pada tahun 1910 dan telah menyebar ke seluruh dunia. Penyakit yang disebabkan bakteri Cmm

ini dapat mengakibatkan kehilangan hasil yang serius pada tanaman tomat yang ditanam di rumah kaca dan di lapangan. Kerugian hasil yang disebabkan kanker bakteri di Amerika Serikat, Kanada, dan Kenya dilaporkan mencapai 50 - 80% Chang et al. (1992). Menurut Hausbeck et al. (2000), penyakit kanker bakteri dapat mengakibatkan kerugian sebesar 300 ribu dolar AS per tahun pada pertanaman di Michigan.

Sebaran geografi

CABI (2007) menyatakan bahwa Cmm telah terdapat di negara-negara Eropa (Austria, Belarus, Belgium, Bulgaria, Cyprus, Czech Republic, Former USSR, France, Germany, Greece, Hungary, Italy, Lithuania, Netherlands, Poland, Romania, Russian Federation, Serbia and Montenegro, Slovenia, Spain, Switzerland, Ukraine), negara-negara di Asia (Armenia, Azerbaijan, China, India, Indonesia, Iran, Israel, Japan, Lebanon, Turkey), negara-negara di Afrika (Egypt, Kenya, Madagascar, Morocco, South Africa, Tanzania, Togo, Tunisia, Uganda, Zambia, Zimbabwe), negara-negara di Amerika Tengah dan Caribbean (Belize, Costa Rica, Cuba, Dominica, Dominican Republic, Grenada, Guadeloupe, Panama), negara-negara di Amerika Utara (Canada, Mexico, USA), negara- negara di Amerika Selatan (Argentina, Brazil, Chile, Colombia, Ecuador, Peru, Uruguay), dan negara-negara di Oceania (Australia, New Zealand, Tonga).

Di Indonesia, berdasarkan hasil pengujian BBUSKP terhadap sampel pemantauan dari UPT Teluk Bayur (2006, 2007, dan 2008) diketahui bahwa

Cmm telah terdeteksi pada tanaman tomat bergejala dari sentra pertanaman tomat di kabupaten Solok Sumatera Barat. Anwar (2004) berhasil mengisolasi

8

Cmm berhasil dari dua lot benih komersial yang tidak menunjukkan gejala pada tahun 2002.

Deteksi dan Identifikasi Cmm

Deteksi dan identifikasi berdasarkan morfologi dan fisiologi

Cmm merupakan bakteri gram positif, aerob, non-motil, tidak berspora katalase positif, oksidase negatif, berbentuk batang lengkung (CAB International

2007, Schaad et al. 2001). Pada medium SCM, koloni Cmm agak cembung, iregular, mukoida, dengan warna abu-abu sampai hitam (gray-to-black), sedangkan pada media YDC koloni Cmm berwarna kuning cerah sampai kuning tua, cembung, dan mukoida (Fatmi and Schaad 1998).

Identifikasi berdasarkan uji Biolog

Biolog Microstation adalah suatu alat yang digunakan untuk

mengidentifikasi bakteri, kapang, dan jamur dengan membandingkan karakter organisme dengan data base pada software. Data base yang tersedia mencakup lebih dari 1900 spesies bakteri aerob, bakteri anaerob, jamur, dan kapang. Identifikasi bakteri gram positif (termasuk Cmm) berdasarkan uji BiologTM dengan menggunakan mikroplate GP2 yang didesain untuk mengidentifikasi bakteri gram positif yang bersifat aerobik. Mikroplate yang digunakan terdiri dari 95 sumur yang berisi sumber karbon yang berbeda-beda, serta satu sumur berisi air steril sebagai kontrol. Sumuran pada mikroplate yang telah di isi dengan suspensi bakteri, akan bereaksi secara serentak dan memberikan reaksi metabolik dan membentuk pola yang khas sehingga sering disebut “metabolic fingerprint”. Pola reaksi metabolik pada mikroplate Biolog memberikan informasi yang sangat baik. Pola metabolik fingerprint kemudian dibandingkan dan diidentifikasi dengan data base pada software MicrologTM. Identifikasi dengan uji Biolog didasarkan pada reduksi tetrazolium yang merupakan respon dari proses metabolisme (seperti respirasi). Terbentuknya warna ungu pada sumuran mikroplate menunjukkan reaksi positif (Biolog 2003).

Identifikasi berdasarkan uji Double Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (DAS-ELISA)

Deteksi bakteri menggunakan teknik serologi telah meningkat pesat sejalan dengan penggunaan antibodi monoklonal dan rekombinan. Keduanya memungkinkan seleksi target epitop spesifik untuk menghindari hasil positif yang salah (Lopez et al 2003). Metode serologi adalah metode pengujian yang

didasarkan pada keberadaan protein dari bahan yang diuji. Prinsip uji serologi adalah terjadinya reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi yang akan membentuk kompleks antigen-antibodi.

Salah satu diantara teknik serologi yang banyak digunakan adalah ELISA

(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) karena akurasi, kemudahan dan biaya

yang rendah. Teknik ini menggunakan antibodi yang didapatkan dari hewan untuk mengenali protein dari bakteri target. Antibodi dilekatkan pada permukaan sumur dalam microplate dan ekstrak sap tanaman ditambahkan ke dalam sumur. Jika bakteri target terdapat pada tanaman, bakteri tersebut akan melekat pada antibodi. Ekstrak yang tidak terikat akan tercuci sebelum antibodi kedua yang mengenali antibodi pertama ditambahkan. Antibodi sekunder menyebabkan terjadinya pengenalan tidak langsung dari bakteri karena terdapat molekul reporter yang melekat pada antibodi sekunder. Biasanya enzim bereaksi terhadap substrat yang berubah warna, kemudian dideteksi secara visual menggunakan microplate reader yang telah dikalibrasi secara hati-hati (Webster

et al. 2004).

Identifikasi berdasarkan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain reaction (PCR) merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu

Thermocycler. Teknik ini dipakai untuk menggandakan atau memperbanyak

urutan basa DNA spesifik. Deteksi bakteri menggunakan PCR telah banyak digunakan karena sangat sensitif. PCR adalah metode pengujian yang didasarkan pada perbedaan di dalam asam nukleat. Metode deteksi dengan PCR mempunyai keunggulan karena sistem analisisnya cepat, mempunyai sensitifitas yang tinggi, dan dapat mengidentifikasi bakteri patogen dengan titer/jumlah yang sedikit (Babaloka (2003), Lee et al. (1997), Lopez et al. (2003), Pastrik and Rainey (1999).

Metode PCR memerlukan DNA polymerase, dNTPs, molekul DNA template, serta dua buah oligonukleotida sebagai primer. Reaksi amplifikasi sangat tergantung pada keberadaan enzim polymerase sebagai katalisator, terutama yang bersifat tahan panas. Produk PCR kemudian dielektroforesis melalui gel agarose dengan persentase tertentu untuk memisahkan DNA sesuai dengan ukuran molekulnya, kemudian hasil elektroforesis divisualisasi di bawah lampu

10 ultraviolet. Hasil penelitian Alvarez dan Kaneshiro (2007) menunjukkan bahwa pasangan primer CM3 dan CM4 merupakan pasangan primer yang lebih sensitif dibandingkan pasangan primer CMM-5 dan CMM-6 dalam mendeteksi bakteri

Cmm dari benih tomat.

Dalam bidang fitopatologi, metode PCR banyak digunakan untuk tujuan deteksi patogen, identifikasi patogen, maupun karakterisasi keanekaragaman patogen. Dengan demikian, metode PCR secara kontinyu dikembangkan bersama-sama dengan metode konvensional, maupun metode pengujian lainnya untuk mengidentifikasi Cmm.

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2008 sampai dengan Februari 2009 di Laboratorium Bakteriologi dan Laboratorium Bio-Molekuler Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian, Jakarta.

Isolasi dan Identifikasi Cmm dari Tanaman Tomat Bergejala Isolasi Cmm dari tanaman tomat bergejala

Tanaman tomat bergejala kanker bakteri diperoleh dari Unit Pelaksana Teknis (UPT) Karantina Teluk Bayur pada bulan Juli 2008 yang berasal dari pertanaman tomat di Kabupaten Solok, Sumatera Barat. Batang tanaman tomat bergejala disterilisasi permukaan dengan alkohol 70%, kemudian dibilas dengan akuades steril, dipotong dan ditimbang sebanyak 5 gram. Kemudian ditambah 50 ml bufer PBS dan dihancurkan dengan grinder selama 1 menit dan diinkubasi selama 6 jam pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan ke tabung steril, dan dilakukan pengenceran berseri 100-10-10. Dari setiap pengenceran dilakukan

plating pada media SCM dalam cawan petri. Kemudian diinkubasikan pada 27oC,