1 Rancangan formulasi yoghurt probiotik karbonasi 5 2 Karakteristik mikrobiologi dan kimia pada yoghurt dan formula
yoghurt karbonasi 7
3 Uji Hedonik (tingkat kesukaan) panelis terhadap produk 9
4 Populasi BAL pada kondisi pH 2 12
5 Populasi BAL pada kondisi Garam Empedu 12
6 Aktivitas antimikroba terhadap E. coli ATCC 25922 13 7 Aktivitas antimikroba terhadap S. Aureus ATCC 25923 14 8 Aktivitas antimikroba terhadap S. typhimurium ATCC 14028 14 9 Profil asam amino skim susu sapi dan formula yoghurt terpilih 16 10 Persentase angka kecukupan gizi asam amino esensial 17
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pangan fungsional merupakan pangan yang secara alamiah mengandung satu atau lebih senyawa yang mempunyai fungsi fisiologis tertentu yang bermanfaat bagi kesehatan (BPOM RI 2005). Yoghurt merupakan salah satu pangan fungsional yang sudah populer di kalangan masyarakat. Hal tersebut sudah dibuktikan secara ilmiah bahwa yoghurt mengandung zat gizi yang baik dan memberikan dampak positif terhadap kesehatan manusia. Dengan mengonsumsi yoghurt secara teratur dapat menyeimbangkan mikroflora usus, dimana bakteri- bakteri yang merugikan dapat ditekan jumlahnya dan sebaiknya usus akan didominasi oleh bakteri yang menguntungkan (Silvia 2002).
Pengembangan produk yoghurt dengan penambahan bahan-bahan dapat meningkatkan nilai fungsionalnya. Salah satunya dengan penambahan probiotik yang akan menambahkan efek kesehatan dalam saluran pencernaan. Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang ketika dikonsumsi dalam jumlah yang cukup akan memberi manfaat kesehatan bagi penggunanya.Yoghurt probiotik memiliki beberapa keunggulan seperti mampu menurunkan tekanan darah, dapat meningkatkan kekebalan, dan menurunkan kolesterol tubuh (Silalahi 2006).
Perkembangan industri minuman yang terus meningkat dan menciptakan produk minuman baru, membuat konsumen dihadapkan dengan berbagai pilihan minuman. Produk – produk berbasis yoghurt saat ini telah banyak diproduksi, antara lain berupa spoonable yoghurt dan drinking yoghurt baik dengan atau tanpa flavor. Produk soft drink seperti minuman berkarbonasi lebih banyak dikenal masyarakat dan cukup mendominasi pasar minuman yang ada. Hal ini membuat beberapa produsen minuman memproduksi minuman berupa susu fermentasi berkarbonasi tetapi tanpa live culture pada produknya sehingga manfaat dari minuman susu fermentasi kurang maksimal. Dalam rangka pengembangan produk, inovasi pada penelitian ini ingin membuat produk berupa yoghurt probiotik karbonasi dengan mengevaluasi potensi sifat fungsionalnya menjadi penting untuk dikaji.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk 1) mengkaji formulasi yoghurt probiotik karbonasi dan potensi karakteristik viabilitas bakteri asam laktat (BAL) berdasarkan ketahanannya terhadap pH lambung, garam empedu, dan aktivitas antimikroba, 2) Melakukan analisis kadar dan nilai gizi asam amino dari yoghurt probiotik karbonasi.
2
2
TINJAUAN PUSTAKA
Yoghurt
Yoghurt merupakan hasil olahan dari fermentasi susu dengan menggunakan bakteri Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus (Lactobacillus bulgaricus) dan Streptococcus salivarius subsp thermophilus (Streptococcus thermophilus) dan atau BAL lain yang sesuai, dengan atau tanpa penambahan bahan pangan lain dan bahan tambahan pangan yang diizinkan (Badan Standarisasi Nasional 2009). Yoghurt memiliki tekstur yang kental dengan rasa asam (dari akumulasi asam laktat) dan flavor yang khas (dari komponen asetaldehida, sejumlah kecil diasetil dan aseton) merupakan hasil dari aktivitas starter BAL melalui proses fermentasi susu.
Streptococcus thermophillus
Menurut Ray (2003) Streptococcus thermophillus termasuk gram positif, homofermentatif aerob, memproduksi L (+) laktat, asetildehida, dan diasetil dari laktosa. Pertumbuhan tidak dijumpai pada 15 oC, tetapi kebanyakan strain mampu tumbuh pada 50 oC dan memerlukan vitamin B dan beberapa asam amino untuk meningkatkan laju pertumbuhannya. Streptococcus thermophilus berbentuk bulat
dengan diameter ≤ 1μm dan membentuk rantai. Nilai pH optimum
pertumbuhannya adalah 6.5. Pertumbuhan bakteri ini dapat terhenti pada pH 4.2 sampai 4.4 (Buchanan 1987).
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus bulgaricus merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang, bersifat katalase negatif, dan tidak berspora. Pada pH optimumnya yaitu 5.5 bakteri ini dapat tumbuh sangat baik namun pertumbuhannya dapat terhenti pada pH 3.5 sampai 3.8 (Jay 1978). Lactobacillus bulgaricus bersifat homofermentatif dan dapat tumbuh pada suhu 15°C atau lebih menurut (Fardiaz 1992). Produk metabolik utama dari bakteri ini adalah asam laktat dan komponen aroma seperti asetildehid dan diasetil (Ray, 2003).
Probiotik
Food and Agriculture Organization (FAO) (2002) mendefinisikan bakteri probiotik sebagai mikroorganisme hidup yang bila diberikan dalam jumlah yang cukup akan memberikan manfaat kesehatan bagi penggunanya. Suatu bakteri dapat dikatakan sebagai bakteri probiotik apabila memenuhi beberapa kriteria, diantaranya 1) bersifat nonpatogenik dan mewakili mikrobiota normal usus dari inang tertentu, 2) mampu tumbuh dan melakukan metabolisme dengan cepat dan terdapat dalam jumlah yang banyak dalam usus, 3) dapat mengkolonisasi beberapa bagian dari saluran usus untuk sementara, 4) dapat memproduksi asam- asam organik secara efisien dan memiliki sifat antimikroba terhadap bakteri merugikan, 5) mudah diproduksi, mampu tumbuh dalam sistem produksi skala besar dan hidup selama kondisi penyimpanan (Salminen et al. 2004), serta memiliki ketahanan terhadap antibiotik (Widodo 2003).
3 Bifidobacterium lactis
Bifidobacterium. lactis ditemukan dalam konsentrasi tinggi pada usus besar. B. lactis membantu mencegah kolonisasi bakteri patogen dengan cara menempel pada dinding usus dan mendesak bakteri jahat keluar. Bakteri ini menghasilkan asam laktat, asam asetat sehingga menurunkan pH usus dan menghalangi bakteri yang tidak diinginkan. B. lactis termasuk ke dalam bakteri gram positif, katalase negatif, non motil, tidak membentuk spora, bersifat anaerobik, dan berbentuk batang (Wahyudi dan Samsundari 2008).
Lactobacillus acidophilus
Menurut Gomes dan Malcata (1999) Lactobacillus acidophilus merupakan bakteri gram positif yang berbentuk batang dengan ujung berbentuk bulat. Bakteri ini dapat sebagai sel tunggal maupun berpasangan dalam rantai pendek. Ukuran panjang dari L. acidophilus adalah 1.5-6.0 µm dan lebar adalah 0.6-0.9 µm. Bakteri ini tidak bergerak, non motil, tidak berspora, dan toleran terhadap garam. Pertumbuhan L. acidophilus dapat terjadi pada suhu tinggi seperti 45 oC, optimal pada suhu 35-40 oC. Toleransi asam bervariasi dari 0.3% hingga 1.9%, dengan pH optimum pada nilai 5.5-6.0.
Berdasarkan penelitian Riwayati (2012), L. acidophilus terbukti dapat menghambat pertumbuhan S. enteriditis bahkan mampu menyebabkan kematian Salmonella spp. L. acidophilus memiliki kemampuan untuk mencegah perlekatan, perkembangbiakan, dan penurunan patogenitas bakteri enterogen. Selain itu bakteri ini juga dapat memproduksi rantai pendek asam lemak terbang sehingga akan menurunkan pH lumen usus, yang tidak menguntungkan bagi pertumbuhan bakteri enteropatogen, menghasilkan substansi yang bersifat menghambat metabolit yang diperlukan oleh bakteri patogen dan memproduksi senyawa spesifik seperti bakteriosin yang bersifat bakterisidal. Selvia (2010) menambahkan bahwa bakteri ini mampu bertahan dalam kondisi 0.5% garam empedu dan merupakan salah satu bakteri asam laktat yang dapat menghasilkan senyawa antimikroba berupa asam organik, bakteriosin, dan hidrogen peroksida.
Minuman Berkarbonasi
Minuman berkarbonasi adalah minuman yang mengandung gas CO2 murni. Minuman ini diproses dengan cara penyerapan CO2 oleh air atau larutan didalam sebuah tangki dengan temperatur rendah yang bertujuan untuk memberikan rasa segar, mengembangkan aroma, dan mencegah pertumbuhan mikroorganisme didalam minuman tersebut, selain itu CO2 merupakan gas yang bersifat mulia,aman karena tidak mudah bereaksi dengan zat yang lainnya untuk membentuk zat-zat yang berbahaya,sehingga merupakan zat pengawet yang aman untuk dikonsumsi (Varnam dan Sutherland 1994). Penambahan gas CO2 untuk produk minuman pada umumnya berkisar 1% - 3% atau 10 000 ppm – 30 000 ppm, penambahan lebih dari 50 000 ppm dapat menganggu metabolisme makhluk hidup (Karagul 2001).
4
3
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu Departemen IPTP, Laboratorium Seafast IPB dan PT. Saraswanti Indo Genetech. Waktu penelitian dilaksanakan pada Bulan Juni 2014 hingga Agustus 2014.
Bahan
Bahan utama yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah susu skim sapi, sirup, botol tutup karbonasi (bahan plastik PE), CO2 dan air. Kultur yang digunakan yaitu kultur yoghurt probiotik komersial (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus) (Yo-MIXTM, Perancis), Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, dan Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Analisis mikrobilogis dilakukan dengan deMann Rogosa Sharpe Agar (MRSA) dan akuades.
Alat
Alat yang digunakan pada pembuatan yoghurt karbonasi adalah wadah susu, sodamaker (Whip-It, USA), thermometer, panci double wall, dan inkubator. Alat yang digunakan dalam pengujian adalah Gas Chromatography (GC) (Agilent Technologies, USA), pH meter, Viskometer dan perangkat analisis High Performance of Liquid Chromatography (HPLC) (Agilent Technologies, USA).
Prosedur
Pembuatan Stirred Yoghurt Probiotik (Tamime dan Robinson 1999)
Susu skim sebanyak 12 liter dipasteurisasi pada suhu 80oC selama 30 menit dalam panci double wall kapasitas 15 liter. Susu didinginkan dalam wadah hingga suhu 37oC dan diinokulasi starter yoghurt probiotik komersial bubuk (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus) (Yo-MIXTM) ditambahkan dalam susu sebanyak 0.02 gram per liter susu. Inkubasi dilakukan pada suhu 37oC selama 18 jam. Peubah mutu yoghurt yang diukur adalah pH, total asam tertitrasi dan total BAL.
Formulasi Pembuatan dan Penyimpanan Yoghurt Probiotik Karbonasi Komponen yang digunakan pada formulasi ini adalah yoghurt (60% dan 80%), air (20% dan 40%), dan gas CO2 (8 g dan 16 g). Berikut rancangan formulasi yoghurt karbonasi pada Tabel 1.
5 Tabel 1 Rancangan formulasi yoghurt probiotik karbonasi
Formula Proporsi Formula (per 800ml)
Yoghurt Air CO2
I 640 ml (80%) 160 ml (20%) 8 g II 640 ml (80%) 160 ml (20%) 16 g III 480 ml (60%) 320 ml (40%) 8 g IV 480 ml (60%) 320 ml (40%) 16 g
Proses diawali dengan pencampuran yoghurt dengan air dan dihomogenisasi pada suhu 4oC. Formulasi yoghurt dimasukkan ke dalam tabung karbonator dalam keadaan dingin dan tabung karbonator ditutup. Injeksi CO2 ke dalam tabung karbonator dan didistribusikan ke dalam botol. Yoghurt disimpan selama 18 hari dan dilakukan penghitungan jumlah BAL setiap 3 hari. Selama penyimpanan, yoghurt dikemas dalam botol kemasan minuman karbonasi (Berbahan PET/Polyethylene Terephthalate) sebanyak 130 ml dan disimpan dalam suhu 4oC. Peubah yang diamati adalah pH, total asam tertitrasi dan total BAL. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan.
Analisis Sensori Yoghurt Probiotik Karbonasi
Yoghurt probiotik karbonasi selanjutnya diuji hedonik (Tingkat Kesukaan) terhadap atribut aroma, rasa, kekentalan, keasaman, warna, dan penampilan umum dengan jumlah panelis 30 orang tidak terlatih. Skala skor kesukaan 1-5. Skor 5 = sangat suka, 4 = suka, 3 = netral, 2 = tidak suka, 1 = sangat tidak suka.
Potensi Karakteristik Fungsional Yoghurt Probiotik Karbonasi Fomula Terpilih
Berdasarkan karakteristik empat formula yoghurt, dipilih dua formula terbaik yang diuji lanjut untuk potensi karakteristik fungsional. Penilaian yang terpilih dilihat dari hasil uji organoleptik dan viabilitas BAL tertinggi setelah proses penyimpanan. Potensi karakteristik fungsional yang diuji yaitu pengukuran ketahanan BAL terhadap pH lambung, garam empedu dan uji antimikroba, serta analisis kandungan asam amino.
Pengukuran Ketahanan BAL Terhadap pH Lambung dan Garam Empedu (Lin et al. 2006)
Pengujian ketahanan terhadap pH lambung menggunakan 10% yoghurt yang dimasukkan ke dalam PBS (Phosphate Buffer Saline) dan diatur keasamannya menggunakan HCl sampai mencapai pH 2, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 3 jam, dan dilakukan pengenceran pada media BPW (10-3, 10-4, 10-5) serta pemupukan untuk penentuan jumlah populasi dengan metode pour plate. Selanjutnya, diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC. Setelah 48 jam dilakukan perhitungan koloni yang tumbuh. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan dengan setiap ulangan duplo.
Uji ketahanan terhadap garam empedu dengan menyesuaikan kadar garam empedu pada saluran pencernaan yaitu dengan menggunkan bile salt sebanyak 0.3% oxgall b/v dalam media PBS basal dengan pH 7.2 yang telah distrelisasi pada suhu 121oC selama 15 menit. Inokulasi yoghurt pada media PBS lalu
6
diinkubasi pada suhu 37oC selama 3 jam. Setelah 3 jam dilakukan perhitungan koloni yang mampu bertahan pada garam empedu. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan dengan setiap ulangan dilakukan duplo.
Aktivitas Antimikroba (Lay 1994)
Bakteri uji yang digunakan adalah Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, dan Salmonella Typhimurium ATCC 14028 yang diinokulasikan dalam aqudest steril dengan konsentrasi sel 108 cfu/ml (Dengan cara membandingkan larutan standart 0.5 Mc Farland). Uji aktivitas antimikroba dengan metode difusi agar. Isolat bakteri diambil sebanyak 250 µl dan dimasukkan ke dalam 25 ml media Muller Hinton Agar dan diratakan, kemudian tutup cawan petri. Setelah agar mengeras, sumur dibuat dengan menggunakan tabung durham berdiameter 5 mm sebanyak 4 sumur setiap cawannya. Inokulasikan antimikroba ke lubang cawan dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam, setelah itu dilakukan pengukuran diameter zona bebas bakteri. Percobaan dilakukan tiga kali ulangan dengan pengukuran data dilakukan secara duplo.
Pengukuran Profil dan Kadar Asam Amino Yoghurt (Nollet 1996)
Analisis asam amino, dimulai dengan melarutkan sampel sebanyak 0,1 gram yang dihidrolisis ke dalam 5 ml HCl 6 N selama 22 jam pada suhu 110oC. Kemudian dinginkan dan pindahkan ke labu ukur 50 ml, lalu tambahkan aquabidest sampai tanda batas dan saring larutan dengan filter 0,45 µm. Ambil filtrate dengan pipet sebanyak 500 µl lalu tambahkan 40 µm AABA dan 460 µ l aquabidest. Homogenkan lalu pipet larutan sebanyak 10 µl dan tambahkan 70 µl AccQ-Fluor Borate lalu divortex. Hasil ditambahkan 20 µl reagent fluor A lalu vortex dan diamkan selama satu menit. Lakukan inkubasi selama 10 menit pada suhu 55 oC. Selanjutnya injeksikan pada HPLC. Konsentrasi asam amino dinyatakan dalam µmol AA dalam sampel.
Rancangan Percobaan
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan model rancangan sebagai berikut:
Yij = μ + Pi + εij
Keterangan :
Yij : Variabel respon akibat perlakuan formulasi yoghurt ke-i (1, 2, 3, dan 4) dan ulangan ke-j (1, 2 dan 3)
µ : Nilai rata-rata respon yoghurt
Pi :Pengaruh perlakuan formulasi yoghurt, air dan CO2 terhadap respon yoghurt karbonasi
εij : Pengaruh galat percobaan perlakuan formulasi yoghurt, air dan CO2 pada ulangan ke-j (1, 2 dan 3)
Analisis Data
Data dilakukan uji kenormalan, keaditifan, dan kehomogenan terlebih dahulu. Data diolah dengan analisis ragam (ANOVA). Data jumlah mikroba ditransformasi menjadi nilai log. Jika analisis menunjukkan perlakuan
7 berpengaruh nyata terhadap peubah yang diamati, maka dilanjutkan uji perbandingan berganda menggunakan uji Tukey (Steel dan Torrie 1997).