SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Spesies Fusarium spp. penghasil fumonisin dan pengelompokannya……. 7 2 Jenis-jenis fumonsin dan gugus fungsinya ………... 10 3 Kontaminasi fumonisin pada berbagai jenis komoditas pertanian
yang digunakan sebagai bahan pangan maupun pakan di Indonesia ... 15 4 Perbedaan sifat antara sistem imun no spesifik dan spesifik ... 21 5 Perbedaaan sifat antara antibodi poliklonal dan monoklonal ... 29 6 Galur-galur mieloma dan limfoblastoid yang dapat digunakan untuk
produksi hibridoma ... 31 7 Perlakuan pada produksi fumonisin dengan menggunakan media jagung . 55 8 Jadual imunisasi mencit BALB/c untuk pembuatan antiserum ... 70 9 Komposisi gel elektroforesis yang digunakan untuk konfirmasi
pembentukan antigen FB1-Ova dan FB1-HRP enzim konjugat... 72 10 Pengukuran protein dari antigen FB1-Ova dengan spektrofotometer ... 78 11 Pengukuran protein dari FB1-HRP enzim konjugat dengan
spektrofotometer... ... 81 12 Program imunisasi mencit BALB/c dangan FB1-Ova secara intra vena .. 90 13 Respon antibodi yang terdeteksi pada serum mencit yang diimunisasi
Dengan FB1-Ova pada pengenceran 1:5.000 ... 97 14 Pengukuran protein dari antibodi dalam supernatan setelah pemurnian melalui kolom HiTrap Protein A HP dengan spektrofotometer ... 102 15 Pengukuran protein dari antibodi dalam cairan asites mencit
setelah pemurnian melalui kolom HiTrap Protein A HP pada
spektrofotometer ... 103 16 Rekoveri FB1 pada sampel jagung yang dideteksi menggunakan
metode ELISA kompetitif langsung berbasis antibodi monoklonal ... 116 17 Analisis FB1 pada jagung dengan ELISA kompetitif langsung dan
KCKT ... 126 18 Konsentrasi FB1 dalam pakan ayam pedaging selama penyimpanan …… 121 19 Konsentrasi FB1 dalam pakan ayam petelur selama penyimpanan ... 121
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 Kontaminasi kapang Fusarium spp. pada jagung hibrida lokal,
morfologi F. verticillioides dan F. nygamai koleksi Bbalitvet
Culture Collection (BCC) ... 8
2. Struktur dasar fumonisin (Rheeder et al. 2002) ... 8
3 Bosintesis fumonisin (Abbas et a.l 1996) ... 9
4 Struktur kimia fumonisin B1 (EHC 2000) ... 10
5 Perbandingan struktur fumonisin dan sfingosin ... 12
6 Struktur dasar imunoglobulin (Ig) ... 25
7 Kinetika respons antibodi: Pembentukan IgM sebagai respon primer dan pembentukan IgG pada respon sekunder ... 26
8 Antigen dengan berbagai epitop ... 26
9 Produksi antibodi poliklonal oleh sel B ... 27
10 Produksi antibodi monoklonal oleh sel B ... 28
11 Struktur kimia polietilen glikol (PEG) ... 32
12 Sistem seleksi dengan medium HAT ... 33
13 Tahapan pada ELISA kompetitif langsung (Rittenberg 1990) ... 38
14 Tahapan pada ELISA kompetitif tidak langsung (Rittenberg 1990)... 39
15 Kontaminasi alami kapang Fusarium spp. pada jagung lokal ... 54
16 Pertumbuhan kapang F. moniliforme dan F. nygamai pada media PDA setelah inkubasi 7 hari pada suhu 25oC dan 37oC ... 57
17 Pertumbuhan kapang F. moniliforme dan F. nygamai pada media jagung setelah inkubasi 7 hari ... 57
18 Pola produksi FB1 oleh F. Moniliforme dan F. nygamai pada media jagung dengan suhu penyimpanan 25oC dan 37oC ... 59
19 Konsentrasi FB1 pada tiap fraksi ekstrak biakan F. verticillioides ... 60
20 Fumonisin B1 pada ekstrak biakan F. moniliforme setelah pemurnian melalui XAD-2 dan deteksi dengan HPLC ... 61
Halaman
22 Konfigurasi antigen FB1-Ova, antiserum, goat anti-mouse IgG-HRP enzim konjugat pada dot blot immunoassay dan ELISA tidak langsung ... 76 23 Konfirmasi hasil sintesis antigen FB1-Ova ............... 77 24 Konfirmasi pembentukan FB1-HRP dan ELISA kompetitif langsung ... 79 25 Konfigurasi antibodi/antiserum, antigen, FB1-HRP enzim konjugat
pada ELISA kompetitif langsung ... 80 26 Konfirmasi pembentukan FB1-Ova dan FB1-HRP dengan
SDS-PAGE ... 82 27 Pertumbuhan sel mieloma Sp2/0-Ag14 pada fasa logaritmik dalam
medium RPMI mengandung 10% FBS ... 98 28 Proses fusi antara sel mieloma dengan sel limfosit ... 99 29 Klon-klon dari sel hibridoma yang tumbuh 6 minggu setelah fusi ... 99 30 Proses kloning dari sel hibridoma dan kultur sel dari klon 2B1F6
dalam medium RPMI mengandung 10% FBS ... 100 31 Grafik pertumbuhan sel hibridoma klon 2B1F6 yang dikultur kembali
dalam medium RPMI setelah penyimpanan dalam nitrogen cair selama satu bulan ... 101 32 Pola grafik fraksinasi imunoglobulin G (IgG) dari supernatan pada
kolom HiTrap Protein A HP ... 102 33 Pola grafik fraksinasi imunoglobulin G1 (IgGi) dari cairan asites
pada kolom HiTrap Protein A HP ... 104 34 Uji sub kelas imunoglobulin (Ig) yang disekresikan sel hibridoma
subklon 2B1F6F7 pada supernatan dengan ELISA penangkap
menggunakan kit identifikasi subkelas imunoglobulin (Sigma) ... 105 35 Konfigurasi ELISA pada pengujian subkelas imunoglubulin dari
Antibodi monoklonal (AbMk) yang dihasilkan oleh sel hibridoma subklon 2B1F6F7 ... 105 36 Analisis imunoglobulin dalam supernatan dan asites mencit setelah
Halaman
37 Performan standar FB1 dan FB2 yang dideteksi secara ELISA kompetitif lansung menggunakan antibodi monoklonal (supernatan)
dari subklon 2B1F6F7 ... 118 38 Pola grafik ELISA kompetitif langsung dan linearitas FB1
menggunakan antibodi monoklonal (supernatan) dari klon 2B1F6 ... 118 39 Kurva kalibrasi standar FB1 dalam matriks jagung pada pengujian
FB1 secara ELISA kompetitif langsung ... 119 40 Korelasi metode ELISA kompetitif langsung dengan menggunakan
AbMk dari klon 2B1F6 dan kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) ... 120 41 Pengaruh penyimapanan terhadap konsentrasi FB1 pada pakan
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Pembuatan pereaksi ... 150 2 Medium dan pereaksi yang digunakan untuk pembiakan sel ... 153 3 Prosedur ELISA tidak langsung untuk uji antibodi pada serum, supernatan
atau cairan asites ... 154 4 Prosedur ELISA kompetitif langsung untuk mendeteksi fumonisin... 155 5 Titer antibodi serum (antiserum) dari mencit yang diimunisasi dengan
antigen FB1-Ova ... 156 6 Pengujian antibodi yang disekresikan oleh sel hibridoma ... 157 7 Pengujian antibodi yang dihailkan oleh subklon 2B1F6F7 dalam
supernatan dan cairan asites ... 158 8 Penentuan kondisi optimum antigen, antibodi dan enzim konjugat untuk
pengujian antibodi secara ELISA tidak langsung ... 159 9 Skrining antibodi dari kultur sel hibridoma ... 160 10 Uji linieritas, sensitivitas dan IC50 secara ELISA kompetiti langsung .... 162 11 Analisis FB1 dalam pakan ayam pedaging secara ELISA kompetitif
langsung ... 163 12 Analisis FB1 dalam pakan ayam petelur secara\ ELISA kompetitif
langsung .. ... 164 13 Analisis varian (ANOVA) perlakuan penyimpanan pakan ayam pedaging
Latar Belakang
Kondisi iklim di Indonesia dengan suhu, kelembaban, dan curah hujan yang tinggi sangat kondusif bagi pertumbuhan kapang penghasil mikotoksin. Kontaminasi mikotoksin seringkali dijumpai pada bahan pangan dan pakan terutama yang berasal dari produk pertanian. Hal ini perlu mendapat perhatian karena selain berbahaya bagi kesehatan manusia dan hewan, kontaminasi mikotoksin juga menurunkan kualitas dan kuantitas produk pertanian sehingga berdampak bagi perekonomian.
Fumonisin merupakan salah satu mikotoksin yang ditemukan di sebagian besar negara-negara di dunia, terutama di negara beriklim tropis dan subtropis. Fumonisin dihasilkan oleh kapang Fusarium spp. terutama F. verticillioides (= F. moniliforme) dan F. proliferatum. Fumonisin semakin menjadi perhatian dunia dan termasuk lima mikotoksin penting yang dijadikan persyaratan mutu produk pertanian dan hasil olahannya pada perdagangan dunia.
Fumonisin B1 (FB1) adalah jenis fumonisin yang paling toksik dan banyak ditemukan di alam. IARC (1993) mengklasifikasikan FB1 sebagai karsinogen golongan 2B, yaitu senyawa yang mungkin dapat menyebabkan kanker pada manusia. Berbagai penyakit seperti kanker esofagus dan kerusakan ginjal dilaporkan berkaitan erat dengan konsumsi bahan pangan yang terkontaminasi FB1.
FB1 ditemukan pada berbagai komoditi pertanian, seperti jagung, beras, gandum, sorgum, dan hasil olahannya. Selain itu, FB1 juga ditemukan pada komoditi lainnya seperti tanaman obat dan teh hitam. Kontaminasi FB1 pada pakan ternak menimbulkan sindroma yang disebut ”leukoencephalomalacia” (LEM) pada kuda, pembengkakan paru-paru pada babi, kanker hati dan ginjal pada tikus, serta imunosupresi pada ayam. Selain itu juga menyebabkan adanya residu pada daging, hati dan ginjal (Smith & Thakur 1996), serta susu (Spotti et al. 2001).
Pada umumnya konsentrasi FB1 yang terdeteksi pada jagung di atas 300 mg/kg (EMAN 2003). Di negara tempat terjadinya kasus kanker esofagus seperti
Afrika Selatan konsentrasi FB1 tertinggi 118 mg/kg pada jagung, sedangkan di Cina berkisar antara 0,5-16 mg/kg. Ali et al. (1998) mendeteksi FB1 pada jagung asal Jawa Tengah pada kisaran konsentrasi 0,02-2,44 mg/kg. Sedangkan Yamashita et al. (1995) melaporkan bahwa kontaminasi FB1 pada jagung di provinsi yang sama berkisaran antara 0,05-1,8 mg/kg. Sementara itu, rataan FB1
pada jagung yang digunakan sebagai bahan baku pakan di Jawa Barat sebesar 12,9 mg/kg (Maryam et al. 2000b).
FB1 stabil terhadap panas dan tidak rusak selama proses produksi, oleh karena itu pemaparannya pada manusia cukup tinggi. Menurut laporan EHC (2000) pemaparan FB1 di Kanada berkisar antara 0,017-0,089 µg/kg BB/hari, USA 0,08 µg/kg BB/hari, Eropa 0,006-7,1 µg/kg BB/hari, dan tertinggi di Afrika Selatan yaitu 14-440 µg/kg BB/hari. Berdasarkan data tersebut pada pertemuan
Joint FAO/WHO Expert committe on Food Additives (JECFA) tahun 2001 ditentukan batas konsumsi FB1 yaitu 2 µg/kg BB/hari.
Selain efeknya pada kesehatan manusia dan hewan, kontaminasi fumonisin berdampak terhadap perekonomian suatu negara. Kerugian ekonomi yang dialami Amerika mencapai US $40 juta, sedangkan kerugian yang lebih besar dilaporkan di alami Cina, Argentina, dan negara-negara di Afrika. Hal ini disebabkan karena semakin ketatnya standar yang diterapkan oleh negara-negara di dunia (Wu 2006). Meskipun di Indonesia belum ada laporan mengenai kerugian ekonomi dan mikotoksikosis pada manusia dan hewan yang disebabkan oleh fumonisin, namun data penelitian yang mengindikasikan adanya kontaminasi FB1 pada produk pertanian dengan konsentrasi yang tinggi akan berdampak terhadap perekonomian nasional.
Untuk mengetahui adanya kontaminasi fumonisin pada suatu komoditi dibutuhkan metode analisis yang dapat diandalkan. Metode analisis memiliki peranan penting dalam menentukan kualitas produk pertanian dan hasil olahannya. Analisis fumonisin umumnya menggunakan metode khromatografi, seperti khromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau khromatografi gas / cair -spektroskopi massa (GC/LC-MS) yang membutuhkan peralatan dan pereaksi yang mahal, serta waktu analisis yang lama. Metode lain seperti biosensor, imunosensor, imunohistokimia, polymerase chain reaction (PCR) atau
PCR-ELISA juga telah dikembangkan untuk deteksi fumonisin dan kapang Fusarium
spp. penghasil fumonisin, namun metode-metode tersebut masih jarang digunakan karena membutuhkan ketrampilan yang tinggi.
Di antara metode analisis, imunoasai merupakan metode yang paling mudah diaplikasikan, cepat, sensitif, spesifik dan tidak membutuhkan pereaksi atau peralatan yang mahal (Chu 1996). Salah satu metode imunoasai yang banyak dikembangkan yaitu enzyme-linked immunoassay (ELISA) dengan menggunakan antibodi poliklonal atau monoklonal. Penggunaan antibodi poliklonal tidak spesifik karena dapat bereaksi positif dengan senyawa yang memiliki struktur mirip fumonisin sehingga menyebabkan kesalahan dalam pengukuran dan kurang sensitif. Untuk mengatasi permasalahan tersebut dikembangkan teknik ELISA dengan menggunakan antibodi monoklonal.
Produksi antibodi monoklonal untuk deteksi fumonisin dikembangkan dengan menggunakan imunogen FB1-KLH (Barna-Vetro et al. 2000), fumonisin B1-cholera toxin (FB1-CT) dan anti-idiotipe. Namun, untuk proses konjugasi dengan KLH dibutuhkan FB1 yang banyak (>700 molar). Konjugasi FB1 dengan CT menghasilkan titer antibodi dengan sensitivitas yang rendah sehingga perlu ditingkatkan melalui kompleks avidin dan streptavidin (Yeung & Newsome, 1995), begitu pula dengan FB1-BSA (Azcona-Olivera et al. 1992a). Oleh karenanya diperlukan suatu protein pembawa yang dapat berkonjugasi dengan FB1 secara mudah, aman dan ekonomis. Ovalbumin (Ova) dapat dijadikan sebagai protein pembawa untuk membuat antigen.. Sejauh ini, FB1-Ova umumnya digunakan sebagai antigen pelapis pada pelat ELISA (Azcona-Olivera et al. 1992) sehingga dapat diasumsikan bahwa FB1-Ova dapat menstimulasi respon imun untuk memproduksi antibodi. Berdasarkan pertimbangan tersebut maka pada penelitian ini digunakan FB1-Ova sebagai antigen untuk menghasilkan antibodi monoklonal melalui produksi sel hibridoma.
Perumusan Masalah
Teknik deteksi yang cepat, sensitif dan spesifik mempunyai peranan penting dalam mencegah dan mengurangi efek fumonisin terhadap kesehatan manusia dan hewan, serta kerugian ekonomi. Imunoasai merupakan teknik deteksi
yang memenuhi kriteria tersebut. Dengan deteksi cepat, kerugian dan bahaya yang ditimbulkan oleh adanya fumonisin pada bahan pangan dan pakan dapat dimonitor sehingga mutu dan keamanannya dapat terjaga. Pengembangan imunoasai untuk deteksi fumonisin dapat dilakukan dengan menggunakan antibodi poliklonal maupun monoklonal, namun ditinjau dari spesifitas dan sensitivitasnya antibodi monoklonal lebih baik daripada antibodi poliklonal.
Untuk menghasilkan antibodi monoklonal dibutuhkan imunogen. Oleh karena fumonisin merupakan senyawa dengan bobot molekul rendah, maka dibutuhkan suatu protein pembawa untuk menjadikannya senyawa imunogenik yang dapat menstimulasi pembentukan antibodi. Protein pembawa yang sering digunakan adalah KLH dan CT. Meskipun kedua protein tersebut memberikan respon antibodi yang baik, namun KLH sulit diperoleh dan harganya mahal sedangkan CT bersifat toksik dan berbahaya. Ovalbumin (Ova) mempunyai prospek yang baik untuk digunakan sebagai protein pembawa alternatif karena dapat dikonjugasikan dengan FB1 secara mudah, ekonomis dan aman.
Tujuan Penelitian
Tujuan umum dari penelitian ini yaitu produksi antibodi monoklonal dengan menggunakan FB1-Ova sebagai imunogen untuk mendeteksi fumonisin pada bahan pangan atau pakan secara ELISA.
Untuk deteksi fumonisin secara ELISA tak langsung dibutuhkan antibodi spesifik dan FB1-HRP enzim konjugat, maka tujuan khusus dari penelitian ini adalah: (1) Sintesis antigen FB1-Ova dan FB1-HRP enzim konjugat, (2) Produksi antibodi monoklonal menggunakan FB1-Ova sebagai antigen, (3) Penentuan kondisi optimum dan standardisasi ELISA kompetitif langsung yang dikembangkan untuk mendeteksi fumonisin melalui pengukuran presisi, akurasi, sensitivitas, spesifitas, linieritas, pengaruh matriks sampel dan perbandingan dengan metode KCKT.